Введение к работе
Актуальность теми
Как известно, белки являются участниками многих биологических процессов и выполняют разнообразные функции, обеспечивающие жизнедеятельности биологических систем. За последние годы стало многое известно о структурной организации белковых молекул. Благодаря успехам рентге-поструктурного анализа мы имеем данные о координатах атомов полипептидной последовательности и молекул связанной воды для большого числа белков. Однако, в то время как пространственная структура белка может быть определена очень точно, конкретные физические механизмы, обеспечивающие температурную стабильность белков до копца не ясны. Многочисленные попытки расчетным путем установить закономерности стабилизации глобул известной структуры натпвного белка не привели к желаемой ясности, однако, они помогли осознать, что разрешить эту проблему нельзя 6cj термодинамического исследования процесса структурной организации белка или обратного ему процесса денатурации под действием различных факторов, в том числе температуры. Изучение термодинамических характеристик тепловой денатурации белка дает информацию о внутримолекулярных взаимодействиях и о взаимодействиях биополимеров с водой, позволяет связать структуру белка с его функционированием.
Среди обсуждаемых фактории, обеспечивающих стабильность нативных белковых глобул, наибольшие дискуссии вызывает связанная рода. Известно, что функционирование живых и даже модельных белковых систем невозможно в отсутствие воды. Это обусловлено тем, что вода играет важнейшую роль в организации и функционировании биополимеров. Все это определяет актуальность проблемы денатурации белков и необходимость выяснения конкретной роли воды в термостабильности биополимеров.
Самостоятельное значение имеют исследования, среди прочих глобулярных белков, поверхностного А-белка, образующего из мономерных субъеди-
ниц упорядоченную сеть на внешней оболочке мембран бактерий Aeromonas salmonicida. Эти бактерии вызывают тяжелое заболевание у лососевых рыб, но не обладают вирулентностью в отсутствие оболочки поверхностного А -белка. Методами электронной микроскопии получены картины распредгло ния А-белка на поверхности клетки. Он образует регулярные гексагональные или тетрагональные структуры, но принципы самосборки таких структур но обсуждаются из-за отсутствия термодинамических характеристик мономерного белка.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось установление закономерностей термодинамических параметров тепловой денатурации в ряду глобулярных белков с различной молекулярпой массой и выявление вклада воды в исследуемые параметры.
Вклад в стабилизацию нативной конформации белков взаимодействий типа биополимер - вода трудно отделить от вклада других внутримолекулярных взаимодействий. Эти затруднения можно решить методом изотопного замещения растворителя, т.е. заменой обычной воды на оксид дейтерия (D2O). Ранее было обнаружено, что малые концентрации дейтерия (менее 1%) могут приводить к большим нелинейным эффектам в ряде биологических и модельных систем. Поскольку табличные значения физико-химических величин, в том числе термодинамических характеристик, в этой области концентраций отсутствуют, целесообразно провести исследование теплоемкости таких растворов. Это даст дополнительнз'ю информацию для обсуждения механизмов обнаруженных нелинейных эффектов.
В задачу рабой и входило:
изучение теплоемкости смесей Я2О — D^O в области малых концентраций дейтерия;
исследование термодинамических характеристик тепловой денатурации глобулярных белков ( поверхностного А-белка, цитохрома, химотри-
псиногена) в Н^О, П^О, анализ изотопного эффектов;
исследование тепловой денатурации белков в растворах с переменным изотопным составом;
анализ днухценгровой модели изотопных эффектов в тепловой денатурации белков, выяснение роли воды в стабилизации нативного состояния белка.
выяснение связи термодинамических характеристик тепловой денатурации глобулярных белков с их молекулярной массой, аминокислотным составом.
Научная новизна.
Методом микрокалориметрии впервые исследован поверхностный А - белок, образующий упорядоченную сеть на внешний поверхности бактерий Aeromonas salmonicida, получены термодинамические характеристики тепловой денатурации белка. Анализ термодинамических изотопных эффектов тяжелой воды в тепловой денатурации А-белка, цитохрома С, а- хи~ мотрипсиногена показал, что специфически связанная с биополимерами вода играет суоіественную роль в обеспечении стабильности их нативного состояния. Сравнение нелинейных экспериментальных зависимостей температуры денатурации белков от концентрации тяжелой воды в растворе с результатами модельных расчетов свидетельствует о предпочтительном связывании белком тяжелой веды и о наличии кооперативных эффектов при связывании воды.
Предложенный метод калибровки микрокалориметра позволил корректно измерить парциальную теплоемкость разбавленных растворов D;0 с содержанием дейтерия менее 1%. Показано, что теплоемкость таких растворов линейно связана с концентрацией дейтерия в воде. Полученный результат не допускает простого объяснения для наблюдаемых нелинейных биологических эффектов в живых и модельных системах в области очень малых концентраций дейтерия.
Практическая ценность.
Знание общих закономерностей изменения термостабильности белков и вт>:лада растворителя - воды в измеряемые термодинамические параметры необходимо, т.к. увеличение термостабильности белков и ферментов диктуется рядом задач практической биотехнологии. Установленная роль воды должна учитываться в генно-инженерной технологии, направленной на стабилизацию белковых глобул. Найденные термодинамические характеристики поверхностного А-белка будут использоваться при создании физической модели взаимодействия белка с поверхностью клетки и образования на поверхности бактерий упорядоченных комплексов, обеспечивающих вирулентность Aeromonas salmonicida и высокую толерантность к лекарственным препаратам. Полученные результаты будут способствовать также разработке методов борьбы с опасным заболеванием лососевых рыб, вызываемым бактериями A.salmonicida.
Предложенный метод калибровки микрокалориметра но известной зависимости теплоемкости растворов простых солей от их концентрации в растворе существенно расширяет возможности прибора в области больших тепловых эффектов, выявляет область нелинейности прибора ДАСМ-4 и позволяет корректно измерять парциальную теплоемкость разбавленных растворов различных веществ, в том числе растворов D^O с содержанием дейтерия менее 1%.
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации докладывались на международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов 96" и "Ломоносов 97". Секция физики. ( Москва, МГУ, 1996, 1997). Основные результаты диссертации представлены в 4-х публикациях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 94 страницах, содержит 30 рисунков, 6 таблиц, список литературы