Введение к работе
Актуальность проблемы» В настоящее время считается точно установленным, что вирус гриппа проникает в клетку путем рецепторного эн-доцитоза. При этом генетический материал вирусной частивд, попавшей в клетку в составе эндосомы, оказывается отгороженным от цитоплазмы двумя барьерами - мембраной вирусной оболочки и эндосомы. Следующим этапом в онтогенезе вируса является высвобождение вирусного генома в цитоплазму, так называемая стадия раздевания вируса гриппа. Хотя механизм активации вирусного генома окончат пьно не установлен, доказано, что раздевание вируса гриппа триггируется снижением внутриэндосомального рН ( t&ncu-c<, Мі^т, /Зі?.). Несмотря на то, что звкисление внутренней среды эндосом впервые показано И.И.Мечниковым более века назад, природа этого явления до сих пор не выявлена.
Известно, что вирусы не обладают способностью вызывать снижение рН среды. В то же время закисление окружающей среды активно мета-болизирующимн клетками - широко распространенное явление и показано для организмов самого различного происхождения: бактерий, дрожжей, высших растений и животных клеток. Одной из причин закисления, ранее признававшейся единственной, является выброс конечных продуктов метаболизма, имеющих кислую природу, например, молочной кислоты ( Coniwijv J91S- ). в дальнейшем для бактерий, дрожжей и растений был показан иной механизм - энергозависимый векторный перенос протонов Н*"- АТФазами ( Wrtmo, і9іо ). В клетках животных одним из основных механизмов закисления среды является Na+/H*- обмен, протекающий с участием мембраносвязанного переносчика чувствительного к амилориду C/
Установление природы снижения внутриэндосомального рН, необходимого для реализации стадии раздевания вируса, позволит выявить неизвестные ранее физико-химические механизмы развития и регуліщии размножения вируса гриппа в клетке. Это создает условия не только для понимания механизма действия уже известных прот'Ивогрйппозныг препаратоэ, в частности, ремантадина, но и для целенаправленного поиска и отбора ингибиторов активности вируса гриппа среди веществ,
блокирующих процессы закисления.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является выяснение механизма снижения внутриэндосомального рН и выявление возможности ингибирования гриппозной инфекции на стадии раздевания вируса гриппа путем торможения процессов закисления.
Поставленная цель достигалась путем решения следующих задач:
-
С помощью потенциометрического метода исследовать природу процесса закисления среды инкубации фибробластами эмбрионов кур.
-
Показать участие процессов закисления, осуществляемых мембрано-связанными системами фиоробластов эмбрионов кур, в снижении значений рН внутренней среды вируссодержащих эндосом.
-
Изучить возможность реализации антивирусного действия известного противогриппозного препарата ремантадина посредством блокирования процессов закисления.
-
Показать симбатность эффектов подавления закисления среды клетками и ингибирования репродукции вируса гриппа в клетке, что позволит выявить новый ряд веществ - ингибиторов процессов закисления, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гриппа.
Научная новизна работы отражена в следующих положениях, выносимых на защиту:
Закисление внутренней среды эндосом, формирующихся при инфицировании фиоробластов эмбрионов кур вирусом гриппа осуществляется в результате функционирования NaVH*- обменника и за счет диффузии молочной кислоты.
Одним из путей реализации антивирусного эффекта противогриппозного препарата ремантадина является подавление процессов, ответственных за закисление внутренней среды вируссодержащих эндосом.
Вещества, подавляющие процессы, ответственные за снижение внутриэндосомального рН, обладают выраженным противовирусным действием в отношении вируса гриппа.
Практическое значение. Разработанный подход к проблеме химиотерапии вирусных инфекций позволяет вести целенаправленный поиск и отбор ингиоиторов активности вируса гриппа среди веществ, подавляющих процессы, ответственные за закисление внутренней среды вируссодержащих эндосом.
В результате исследований выявлен новый класс ингибиторов активности вируса гриппа - ингибиторов Ма+/Н*"- обмена и гликолиза.
Обнаружено, что соединения, относящиеся к калийсберегающим ди-
уретическим препаратам - амилорид, верошпирон и триампур обладают выраженной противовирусной активностью в отношении вируса гриппа, что очень важно для химиотерапии и фармакологии.
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторних процессов" ( Минск, 1988); Пленуме проблемной комиссии АМН СССР "Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ" ( Ленинград, І9Б9); Всесоюзном симпозиуме "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций" ( Рига, 1969); Конференции "Биофизика мембран" ( іСаунас, 1990); IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ ( Рига, 1991).
Публикации. Результаты диссертации опубликованы в Э работах.
Структура диссертации. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы, насчитывающего 207 наименований, і.іатериал изложен на 125 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 7 таблиц.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАН'ЛЯ
Фибробласты эмбрионов кур ( ФЭК) получали из отдела культур клеток и питательных сред БелНЯИЭМ МЗ РБ. Использовали двухсуточную монослойную культуру для вирусологической части эксперимента и сус-ленэио трехсуточных клеток для биофизических исследований. ' Вирус гриппа штамм A/FPV Rostock-( H7NI) был получен из коллекции лузея вирусов института вирусологии АМН СССР. Вирус культивировали з аллантоисной полости 10—II суточных эмбрионов кур. ' В работе были использованы следующие вещества и препараты: ами-іорид ( Mb 266,1), уабаин ( Мв 728,6), иодацетат ( Мв 166,1) -'Сигма" ( США); ортованадат'натрия ( Мв 400), оксодолин и диакарб '. в форме таблеток) - отечественного производства; фуросемид ( в Ьорме таблеток) - Болгария; триампур ( в форме таблеток) - Германия; 'ипотиазид ( в форме таблеток) - Венгрия; противогриппозный препарат ремантадин ( Мв 217) был любезно предоставлен Я.Ю.Полисом ( институт органической химии АН1Латвийской республики); иммуноглобулин .-іормальньтй - титр антител к вирусу кори 1:640, производства БелНИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ.
Природі' закислення среды клетками изучали потенциометрическим методом і Антонов и др., 1975). Скорость трансмембранного перенос-протонов оценивали по смещению рН после добавления клеточной суспензии к изотоническому раствору..
- б -
Очистку и концентрацию вируса проводили по методу ]&'r>gsl«ry{ 1966). Осадок вируса суспендировали в 0,15 М растворе NaCf с рН 7,4.
Титр инфекционности вируса гриппа определяли методом негативных колоний под агаровым покрытием ( Porting;еЩ d&5on , I960).
Исследование веществ на антивирусную активность проводили с помощью агар-диффузного скрининг-теста и методом редукции бляшек ( Вотяков и др. 1986).
Оценку проникновения вируса гриппа в клетку проводили по методу, основанному на инактивации вируса, не проникшего в клетку буфером с рН 2,0 ( S-fephenion ef а. , 1976).
Начальные этапы взаимодействия вируса с клетками изучали с помощью электронно-микроскопического метода криофрактографии. Процедуры скалывания, травления, оттенения и напыления выполняли при вакууме 10~6торр на установке УЕЕ-4С ( Джеол, Япония). Реплики просматривали в электронном микроскопе уШ-ЮОСХ ( Джеол, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Для определения структурного состояния плазматических мембран использовали критерий направленности плоскости скола мембран { Кириллов, Конев, 19Ь4; Кириллов, 1990) и характер распределения внутримембранных частиц ( &ranicr? , 1969).
Среднюю квадратическую ошибку высчитывали после троекратного повторения каждого опыта.