Введение к работе
Актуальность темы обусловлена тем, что электростатическое поле.белковой молекулы является одной из ее важнейших физико-химических характеристик, во многих случаях определяющей скорость образования, конфигурацию и стабильность белковых комплексов [Rogers, 1986; Honig и Nicholls, 1995]. Поскольку физиологически значимые процессы (ферментативные реакции и ингибирование, перенос электрона между белками, взаимодействия антитело-антиген и гормон-рецептор) протекают при связывании белков в комплексы, понимание электростатических взаимодействий с участием белков является неотъемлемой частью изучения этих процессов, а успехи белковой инженерии последнего десятилетия дают основание использовать теоретические расчеты электростатических взаимодействий для проектирования белков с заранее заданными свойствами [Getzoff, 1992]. В работе рассмотрены два класса реакций с участием белков - ферментативные и реакции межбелкового переноса электрона, которые, помимо физиологического значения, характеризуются наличием наибольшего числа экспериментальных данных по роли электростатики в их функционировании.
Целью работы было изучение роли зарядовых взаимодействий в супероксид-дисмутазной реакции, реакции ингибирования трипсина и реакциях переноса электрона с участием глобулярных гемсодержащих белков, для чего были поставлены следующие задачи:
- рассчитать распределение электростатического поля вокруг
молекулы фермента супероксид-дисмутазы (SOD) с учетом формы молекулы белка, структуры растворителя и дебаевского экранирования противоионами и изучить влияние этих факторов на супёроксид-дисмутазную реакцию;
- теоретически оценить электростатический эффект химической
модификации лизиновых аминокислотных остатков цитохрома С (Cyt С) на скорость переноса электрона в его реакциях с физиологическими партнерами - оксидазой и редуктазой;
- описать наблюдаемые экспериментально зависимости скорости
переноса электрона между (Cyt С) и различными вариантами миоглобина (Mb), а также между цитохромом В5 (Cyt В5) и различными вариантами Cyt С в рамках известных электростатических моделей. Выявить роль индивидуальных аминокислотных остатков изучаемых белков в электростатических взаимодействиях, влияющих на скорость переноса электрона;
- экспериментально определить амплитуду эффекта модификации
трипсина заряженным полимером (полиионом) на скорость реакции трипсина с его соевым ингибитором в зависимости от ионной силы.
Научная новизна работы состоит в том, что в ней на большом количестве экспериментальных данных расчет электростатических полей белковых молекул применен к анализу измеренных термодинамических и кинетических параметров взаимодействий с участием белков. Проведено систематическое изучение влияния на эти параметры различных факторов, к которым электростатические взаимодействия весьма чувствительны: ионной силы, рН, формы белковой глобулы, структуры растворителя и характера распределения зарядов на поверхности белков. В частности, впервые изучены:
- применимость различных электростатических моделей для
описания зависимостей от ионной силы скоростей межбелкового переноса электрона (Mb - Cyt С и Cyt В5 - Cyt С),
- влияние структуры растворителя на супероксид-дисмутазную
реакцию и реакцию переноса электрона между химически модифицированным по лизиновым остаткам Cyt С и его физиологическими редокс-партнерами,
- влияние модификации белка (трипсина) сильно заряженным
полимером на скорость его взаимодействия с другим белком
(соевым ингибитором трипсина).
Понимание механизмов взаимодействия белков с различными лигандами крайне важно для создания белков с заранее заданными свойствами, что и обусловило практическую значимость настоящей работы, одним из результатов которой явилось повышение скорости реакции фермента трипсина с ингибитором более чем на два порядка за счет введения дополнительных электростатических взаимодействий. В связи с успехами, достигнутыми в последние годы в белковой инженерии, управление электростатическими взаимодействиями стало возможно путем точечной замены заряженных аминокислотных остаткоз. Для фермента супероксид-дисмутазы такое повышение эффективности, предсказанное путем электростатических расчетов, наблюдалось в эксперименте [Getzoff и др., 1992]. Выполненное в настоящей работе моделирование электростатических взаимодействий белков электронного транспорта представляет собой неотъемлемую часть работ по созданию молекулярных электронных устройств, составляющих ныне предмет новой междисциплинарной области прикладной науки - молекулярной электроники [Гильманшин и Лазарев, 1987; Nicolini, 1995].
Апробация работы и публикаций. Результаты работы докладывались на Международной конференции по биосенсорам и
биокомпьютерам (Санта-Клара, США, 1988), II Международной конференции по молекулярной электронике и биокомпьютерам (Москва, 1989) и Международной конференции по вычислительной математике "CSAM-93" (Петербург, 1993). Работа была поддержана Государственным комитетом по науке и технике СССР (1939-1990 гг., проект № 89) и Российским фондом фундаментальных исследований (с 1994 г., гранты № 94-04-12471а, № 96-04-48778). По теме работы имеется 9 публикаций, из них статей в отечественных изданиях - 3 и в зарубежных - 4.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (8 разделов), методической части (5 разделов), результатов и обсуждения (5 разделов), выводов и списка литературы ( и а наименований). Объем диссертации -/уд страниомашинописноготекста. Количество таблиц - У . рисунков - 'Т.