Введение к работе
Актуальность проблемы. Кальций-зависимые фотопротеины представляют собой устойчивые фермент-субстратные комплексы, состоящие из полипептидной цепи - апопротеина (около 20 кДа), молекулы кислорода и целентеразина. В присутствии ионов кальция происходит внутримолекулярная реакция окисления целентеразина с образованием апобел-ка, целентерамнда и молекулы СОг и испусканием кванта света. Характерной особенностью биолюминесцентной реакции, и фотопротеиновоп реакции в том числе, является высокий квантовый выход и низкий уровень шума по сравнению с хемилюминесцентными реакциями. Это позволяет обнаруживать аттомолярные концентрации фотопротеинов и обусловливает перспективность их использования в качестве метки в различных аналитических схемах.
Однако из-за ограниченных количеств природных белков их потенциальные возможности долгое время не были реализованы. Снять эту проблему позволило бы получение рекомбинантных фотопротеинов. Несмотря на то, что к настоящему времени известно около 25 видов люми-несцнрующих морских кишечнополостных, обладающих фотопротенновым типом бнолюминесцентной системы, только шесть из них выделены и частично охарактеризованы. Гены только четырех фотопротеинов клонированы и экспрессированы в клетках бактерий. И только для рекомби-нантного фотопротеина акворина разработаны методы выделения и очистки. Полученный рекомбинантный акворин активно и весьма успешно используется как метка в различных анализах. Несомненными преимуществами фотопротеиновых меток являются простота регистрации люминесцентного сигнала широкий линейный диапазон зависимости люминесценции от концентрации белка высокая чувствительность и безопасность применения
В 1992. году в лаборатории фотобиологии Института биофизики
со РАН был получен другой рекомбинантный фотопротеин обелин из гидроидного полипа Obelia longissima.
Цели и задачи исследования. Целью представленной работы являлось изучение рекомбинантного фотопротеина обелина и исследование возможности ею использования в качестве биолюминесцентной метки в иммунофермеитном анализе (ИФА).
Выполнение данного исследования требовало решения следующих экспериментальных задач:
-
Разработать метод выделения и очистки рекомбинантного апо-фотопротеина обелина из биомассы трансформированных клеток E.coli, на его основе получить высокоочищенный препарат этого белка и исследовать его основные физико-химические свойства.
-
С помощью химических и генноинженерных методов разработать способы получения модифицированных производных рекомбинантного обелииа, пригодных для дальнейшего применения их в качестве биолюминесцентной метки в иммунофермеитном анализе.
-
Продемонстрировать пригодность полученных производных рекомбинантного обелина для использования в качестве биолюминесцентной метки в иммунофермеитном анализе и сравнить их с уже известными ме1ками.
На защиту выносятся следующие ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ: J. Эффективная технология выделения и очистки рекомбинантного фотопротеина обелина и его основные физико-химические свойства.
2. Методы получения производных рекомбинантного обелина, об
ладающих биолюминесцентной активностью и способностью встраи
ваться в иммуноаналитический комплекс.
3. Биолюминесцентный иммуноанализ с использованием меток,
полученных на основе рекомбинантного обелина, характеристики кото
рого не уступают, а иногда и превосходят по основным аналитическим
показателям традиционные мепси - пероксидазную и изотопную. Научная новизна и практическая ценность.
1. Впервые из биомассы трансформированных клеток E.coli в гомо
генном виде получен рекомбинантный фотопротеин обелин. Разработа
на эффективная технология выделения и очистки белка, позволяющая
получать гомогенный препарат с выходом около 50%. Исследованы
основные физико-химические свойства полученного белка: молекуляр
ная масса, спектр поглощения, термостабильность, удельная активность,
константа спада люминесценции, квантовый выход.
2. Методами химической модификации получены биотинилиро-
ванные производные рекомбинантного обелина, обладающие как био-
лю-мннесцентной активностью, так и способностью встраиваться в им
мунный комплекс через авидин-биотиновую систему, пригодные для ис
пользования в ИФА в качестве биолюминесцентной метки.
-
Сконструирован, впервые выделен в гомогенном виде и охарактеризован химерный белок proZZ-Obe, обладающий биолюминесцентной активностью и аффинностью белка А из Staphiloccocus aureus к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G.
-
С помощью полученных производных обелина проведены ИФА альфафетопротеинов в сыворотке крови человека, иммуноглобулинов кролика, мыши и человека и антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке крови.
5. Проведено сравнение биолюмииесцентной фотопротеиновой
метки с традиционно используемыми радиоизотопной и пероксидазной.
Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что синтезированные биолюми'несцентные метки, полученные на основе рекомбинантного обелина, обладают высокой чувствительностью, широким линейным диапазоном зависимости люминесцентного сигнала от концентрации белка, простотой и безопастностью процедуры анализа и
не уступают, а иногда и превосходят по этим показателям традиционные метки - пероксидазную и изотопную. Полученные биолюминесцентные метки могут найти широкое применение в области иммунологии и медицинской диагностики.
На основе разработанной в данной работе технологии очистки ре-комбинантного апообелина налажено его мелкосерийное производство.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Международной конференции по медицинской биотехнологаи, иммунизации и СПИДу (Ленинград, 1991), Ш-й Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1993), Симпозиуме по биолюминесценции (Гаваи, США, 1993), VI1I-0M Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж, Великобритания, 1994), П-й Международной коференции по клинической хемилюминесценции (Берлин, Германия, 1996), 31-ом Европейском симпозиуме по морской биологии (С. Петербург, 1996), 1Х-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Вудсхолл, США, 1996), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и обьем работы. Диссертационная работа изложена на 91 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (71 источников, в том числе 58 иностранных). Диссертационная работа проиллюстрирована 32 рисунками, содержит 5 таблиц.