Введение к работе
Актуальность проблемы. С открытием программированной клеточной смерти (апоптоза) как альтернативы некроза проблема связи первичных повреждений ДНК с гибелью клетки приобрела более конкретные очертания и формулируется как проблема связи типов повреждений ДНК с формами клеточной гибели (проблема включает в себя и механизм трансдукнии первичного сигнала). Исследования в чгой области предполагают 3 варианта ответа на поставленный в проблеме вопрос.
(1) Апоптоз является универсальным механизмом программированной гибели; вне
зависимости от вида повреждений ДНК и природы повреждающею агента, гибель
клетки завершается апоптозом (высокие уровни воздействия индуцируют
некротическую гибель).
(2) Двуиитевые разрывы ДНК (ДР), будучи главной причиной снижения
колоннеобразования пролиферирующих клегок, являются основным типом
повреждений, запускающих апоптоз.
(3) Повреждения ДНК сами по себе не являются причиной апоптоза, но запускают
механизм репарации, в ходе функционирования которого создаются условия для
гибели клетки, генерируется сигнал, запускающий программу гибели.
Предлагаемая работа находится в русле последнего представления. К ному
направлению исследований тесно примыкает так же весьма интересная и пока далекая
от своего решения проблема взаимоотношения механизмов репарации и апоптоза.
Повреждения ДНК, с одной стороны, являются субстратом для реиаратнвных
ферментов в клетке, а с другой стороны, запускают программу клеточной гибели -
апоптоз. Апоптоз проходит через этап деградации ДНК, которой также противостоят
механизмы репарации. Эти два процесса конкурируют не только за субстрат, но и за
энергетические ресурсы клетки, поскольку оба энергозависимы. Результаты
исследований последних лет обнаруживают связь между механизмами апоптоза и
репарации ДНК [см. обзоры Gotz, Montenarh М. 1996, Oliver et al. 1999, Тронов 1999].
Однако, в некоторых исследованиях отмечается отсутствие взаимосвязи апоптоза и
репарации. Здесь примечательными являются работы [Story et al. 1994, Vral et al. 1998]
на клетках мышиной лимфомы и лимфоцитах крови человека, в которых авторы
независимо приходят к выводу, что апоптоз в лих клетках определяется только
начальными ДР и не зависит от репарации ДНК. Как видно, столь противоречивые
данные создают предпосылку для исследований взаимосвязей іненьен цени
"повреждение ДНК - репарация - клеточная гибель (апоиюз)". Исследования мы
проводили главным обраюм на покоящихся лимфоцитах крови человека (ЛКЧ), и
потому результаты работы касаются также проблемы гибели покоящихся клеток,
индуцированной повреждением ДНК. Покоящиеся клетки формируют основной
клеючный пул высших организмов и опухолей. 13 то же время отсутствует ясное
ііредсіанлемие о том, в чем состоит опасность отдельных повреждений в их
нерсмлшшруюшемся геноме. Нестимулированпые к делению лимфоциты
представляют собой благодатный объект для изучения этой проблемы в силу своей высокой чувствительности к повреждениям ДИК. Возможно это связано с криіпчносіью выполняемых ими функций: наиболее важная функция лимфоцитов in \i\o в ответ па антигенный стимул состоит в синтезе антител или в стимуляции пролиферации, приводящей к продукции иммунологически активных дочерних клеток. С друїой стороны, как и во многих долгоживущих клетках, в покоящихся лимфоцитах ні \ічо оімечаеіся заметный уровень конститутивной экспрессии BCL-2, белка, подавляющего апоптоэ и увеличивающею жн (неспособность клеток [Yang, Korsmeyer I Wo, Boviaetal.1998].
> її іалачн исследования. Цель настоящей работы - на покоящихся лимфоцитах крови человека установить связь формы іибели клетки с типом разрывных дефектов ДНК и исследовать влияние процесса репарации дефектов на клеточную гибель.
Достижение этой цели потребовало постановки и решения следующих задач.
-
1'а(работать метод поклеточной регистрации повреждений генома клетки. Оценить сі о но іможносги для регистрации и дискриминации форм клеточной гибели.
-
Исследовать гибель ЛКЧ после их облучения in vitro.
}) Оцсниіь роль ДР в индукции гибели покоящихся клеток.
И Исследовать гибель покоящихся ЛКЧ, индуцированную ОР и роль механизма их репарации
Научили новизна полученных результатов. I (Проведена качественная и количественная оценка возможности метода ДНК-комет для регистрации и дискриминации форм клеточной гибели. Анализ бивариантных распределений комет ІЮ1ВОЛЯСГ дискриминировать преимущественную форму гибели клеток в популяции. Однако, для такой дискриминащіи на уровне отдельной клетки требуется привлечение морфолої ических исследований. 2) Метод позволяет идентифицировать крупноблочную деградацию ДНК на ранних этапах апонтоза. Впервые продемонстрирована корреляция данных, полученных с помощью метода ДНК-комет и рочлыагов морфологической оценки частоты апонтоза ЛКЧ. 3) Прикладные
возможности метода ДНК-комет впервые продемонстрированы на лимфоцитах больных системной красной волчанкой (СКВ) и больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ), подвергнутых тотальному фракционированному облучению (суммарная доза облучения 1 Гр). Показано, что спонтанная поврежденность ДНК в ЛКЧ больных СКВ выше таковой в ЛКЧ здоровых доноров. Частота спонтанного апоиоза ЛКЧ больных СКВ выше, чем у здоровых доноров. 4) Показано, что ЛКЧ больных ХМЛ сохраняют "память" об облучении in vivo в виде более высокой спонтанной поврежденное ДНК в них и более высокой частоты спонтанного апоптоза части клегок, наблюдаемой спустя 2-3 месяца после завершения терапевтического курса. 5) Показано, что гамма-облучение ЛКЧ in vitro и последующая инкубация в среде с пониженным содержанием сыворотки (<5%) индуцировали смешанную гибель клеток, в которой некроз и апоптоз были представлены как два относительно независимых события, к которым приводят два доминирующих вида дефектов ДНК, ОР и ДР.
5) Исследована роль ДР в индукции гибели покоящихся ЛКЧ мод действием
ингибитора топоизомеразы II этопозида. Показано, что формирующиеся ДР в ЛКЧ
сохраняются нерепарированными в течение по крайней мере 8 час, времени начала
проявления признаков апоптоза. Апоптоз сопровождался характерными
морфологическими изменениями клеток, межнуклеосомной деградацией ДНК,
появлением гиподиплоидных клеток, но отсутствием экспрессии р53. Последнее
обусловлено экранированием ДР ковалентно связанной с ним топоизомеразой II
(предположительно ее р-изоформы).
6) Исследована роль ОР и их репарации в индукции гибели ЛКЧ. ОР индуцировали
перекисью водорода (диапазон концентраций 10-400 мкМ). Показано, что (і) Н202
индуцирует в клетках разрывы ДНК, не являющиеся следствием циготоксического
действия агента, (іі) Возникшие ОР запускают программу гибели. Спустя 24 час в
популяции ЛКЧ обнаруживаются какапоптотические, так и некротические клетки. При
концентрациях Н202 > 200 мкМ некроз становится доминирующей формой гибели,
хотя до 15% клеток сохраняют апоптотическую морфологию, (ііі) Апоптоз
сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК и экспрессией р53. (iv) Репарация
ОР осуществляется с участием PARP, так как NAm подавляет репарацию ОР. При этом
резко снижается доля некротических клеток, и в 2 раза возрастает частота апоптоза.
Полученные данные интерпретируются в рамках концепции о де-энергнзирующем
действии на клетки репаративного механизма и определяющей роли снижения уровней
|N/M), ЛТР|І в форме іибели покоящихся ЛКЧ.Н целом работа представляет новое направление исследований - биофшику клеючной гибели. Научно-праклическая значимость.
-
Полученные результаты о связи формы гибели клеток и типов повреждений ДНК внося і сушестенный вклад в решение проблемы, относящейся к области исследования биофи шки клеточной гибели: механизмы передачи сигнала от первичных повреждений і енома до конечного эффекта.
-
Наши результаты свидетельствуют о существенной роли в этом де-энергизации покоящейся клегки, связанной с функционированием системы репарации ДНК. Метод ДНК-комег расширяет ассортимент исследовательских процедур в области биофизики клеї кн.
s) Наши результаты о влиянии этоиозида на ЛКЧ связывают наблюдаемый эффект аіеніа с наличием в лимфоцитах |5-изоформы гопоизомеразы 11, локализованной в ядрышке Ото ставит проблему идентификации расположения на ДНК формируемых сю ДР и пути передачи первичного сигнала, минуя важнейший медиатор р53.
-
Результат о влиянии Н202 подтверждают представление о генотоксическом механизме действия окислительного стресса в широком диапазоне концентраций перекиси. Медиатором трансляции сигнала от первичного повреждения ДНК (ОР) яіілясіся р53. С ростом объема повреждения ДНК возрастает объем репарации и )иері о затраты на нее. Это уменьшает вероятность прохождения апоптоза и увеличивает исрояіііосіь его трансформации в некроз. Все это дополняет наши представления о мехами змах действия окислительного стресса па клетку.
-
Исследования на лимфоцитах больных хроническим миелолейкозом и системной красной волчанкой показывают плодотворность использования метода ДНК-комет для решения многих прикладных задач, связанных с мониторингом радио- и химиотерапии онколошческих заболеваний и заболеваний иммунной системы, а также для оценки іеіероіенности клеточных популяций in vivo и in vitro по чувствительности к ра«личным воздействиям (включая терапевтические).
-
І Іолученьїе результаты могут также быть использованы в разработке тактики терапии рака, основанной на индукции снижения внутриклеточного [ATP|i [Martin DS, Schwartz UK. IW]
Основные положения,выносимые на защиту
- ДНК-кометы служат надежным биофизическим маркером клеточной гибели: (і) предложена классификация типов ДНК-комет, формируемых клетками, определены
соответствующие им размеры фрагментов одно- и двуспиралыюй ДНК; (ii) показано, что они формируются в процессе крупноблочной фрагментации генома на начальной стадии апоптоза (commited phase); (iii) продемонстрирована хорошая корреляция частоты формируемых ДНК-комет с частотой апоптотических лимфоцитов нормальных доноров и больных системной красной волчанкой.
- Облучение покоящихся лимфоцитов в условиях дефицита сыворотки индуцирует в
популяции две формы гибели - некроз и апоптоз: (і) некроз обусловлен де-энергизацией
клетки за счет эффективной репарации ДНК; (ii) апоптоз индуцируется долго
живущими повреждениями ДНК (двунитевыми разрывами); (iii) репарация ДНК играет
роль "антиапоптотического " фактора, влияющего на форму клеточной гибели.
- Ингибитор топоизомеразы II этопозид индуцирует в покоящихся лимфоцитах
нерепарируемые двунитевые разрывы ДНК: (і) на фоне отсутствия репарации в клетках
развивается апоптоз, который не связан с экспрессией р53.; (ii) сигналом для апоптоза
служат конформационные перестройки хроматина - релаксация суперспиральных
доменов ДНК, содержащих разрывы, маскированные топоизомеразой II
- Смена формы гибели апоптоз—иіекроз в ЛКЧ происходит на терминальной стадии в
результате де-энергизации клетки в процессе репарации ДНК: (і) OP эффективно
репарируются и одновременно индуцируют р53-зависимый апомтоі, (ii) репарация OP
связана с функцией PARP: никотинамнд, ингибитор PARP, подавляеі репарацию ДНК;
(iii) подавление репарации защищает клетки от некротической гибели , но не от
апоптоза.
6. Апробация рабогы. Материалы диссертации представлялись и обсуждались на
следующих конференциях и съездах. II Радиобиологический съезд (Киев, 1993); VIII
Международный конгресс по радиационной защите (Монреаль, Канада. 1992); X
Международный конгресс по радиационным исследованиям (Вюрцбург, Германия.
1995); V11I ежегодный съезд Европейского Радиобиологического Общества (Монпелье,
Франция. 1996); IV конференция 1UBMB "Жизнь и смерть клетки" (Лондон, Англия.
1996); I съезд онкологов стран СНГ (Москва. 1997); III съезд по радиационным
исследованиям (Москва. 1997); II съезд биофизиков России (Москва. 1999).
Материалы диссертации докладывались также на семинарах и научных конференциях в Институте химической физики РАН и в Институте биохимической физики РАН.
7. Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения-характеристики
работы, 4 глав, выводов, списка литературы (186 наименований) и содержит 172 стр: 38
рисунков, 5 таблиц. Материалы диссертации изложены в 22 публикациях, в том числе
двухобзорных статьях. Личный вклад автора заключался в постановке рабогы, в
планировании и выполнении большей части экспериментов, в написании всех
публикаций по результатам исследования.