Разработка теоретических основ и методов использования миллисекундной замедленной флуоресценции хлорофилла для анализа фотосинтетической продуктивности и устойчивости растений Моргун, Василий Николаевич

Введение к работе

№ |

^{J 4}"'' 1 Актуальность проблемы. В настоящее время большое внимание

уделяется совершенствованию методов диагностики состояния растений, основанных на измерении люминесценции хлорофилла. Интерес к люминесцентным методам обусловлен высокой чувствительностью, оперативностью измерений, большим объемом получаемой информации о фотосинтетических процессах, а также относительной простотой и компактностью аппаратуры. За последние годы значительный прогресс достигнут в области практического применения переменной и постоянной (нулевой) флуоресценции хлорофилла. Разработаны базовые методические подходы, основанные на измерении фотохимического и энергозависимого компонентов тушения флуоресценции, предложены показатели, количественно связанные с фотосинтезом, созданы соответствующие технические средства (Schreiber at al, I9b9). В то же время заметное отставание наметилось в области применения замедленной флуоресценции хлорофилла. Такое положение сложилось кок в исследованиях механизма фотосинтеза, так и в работах, посвященных решению задач прикладной физиологии (стресса, продуктивности, развития и'др.).

Накопленные к сегодняшнему дню данные позволяют говорить о том, что наиболее привлекательной с точки зрения ближайших перспектив практического использования является миллисекундная замедленная флуоресценция хлорофилла, тесно связанная с запасанием энергии в виде мембранного потенциала тилакоидов. Несмотря на это, диапазон применения миллисекундной замедленной флуоресценции остается гораздо более узким, чем переменной флуоресценции. Среди основных причин этого, во-первых, интегральный характер замедленной флуоресценции как показателя фотосинтеза и ее многокомпонентный состав. Во-вторых, отсутствие детально проработанных представлений о связи замедленной флуоресценции с процессами фотосинтесм. Современный уровень этих представлений по основным положениям обеспечен исследованиями, проведенными еще до конца семидесятых годов. В-третьих, несформированность теоретических основ замедленной флуоресценции как самостоятельного метода исследований. В-четвертых, наибольшая среди люминесцентных методов сложность аппаратуры, ее неунифицированность, возможность альтернативных режимов регистрации замедленной флуоресценции. Ьсе это обусловливает необходимость проведения в боль-

шинстве случаев предварительных исследований для адаптации метода к решению конкретных задач. В других случаях замедленная флуоресценция используется в качестве вспомогательного показателя, интерпретация данных которого ограничивается качественными оценками и приводит к заключениям общего характера. Тем не менее, результаты проведенных ранее теоретических исследований и работ прикладного направления говорят о возможности и целесообразности прівденения замедленной флуоресценции для решения самых различных задач в качестве самостоятельного метода.

Но сравнению с переменной флуоресценцией, метод замедленной флуоресценции имеет некоторые особенности, придающие ему самостоятельное значение в группе люминесцентных методов. Ь числе этих особенностей - качественно иной механизм связи свечения с мембранным, потенциалом тилакоидов и отличная от флуоресценции форма индукционной кривой, легко измеряемая кинетика затухания, позволяющая оценивать скорость переноса электронов в различных условиях;' более информативные термоиндуцированные изменения в области низких физиологических температур и ряд других. Как и переменная флуоресценция, замедленная флуоресценция является чувствительным инструментом для сравнительной оценки параметров фотоскнтетического аппарата с целью выявления их внутривидовой изменчивости при отборе форм культурных растений. В частности, кинетические и амплитудные параметры свечения могут быть использованы без привязки к содержанию хлорофилла, внутривидовые различия которого до настоящего времени не удается ввести в рамки причинно-следственных связей с продуктивностью. В плана совместного использования люминесцентных методов в области .физиологии и экологии большие возможности обещает привлечение замедленной флуоресценции как показателя, свлзанн го с концентрацией активных реакционных центров фотосистемы Z. Наконец, качественных сдвигов в области применения метода замедленной флуоресценции следует ожидать в связи с внедрением новой технической, базы измерений: твердотельных источников модулированного света и электронных систем модуляции возбуждения и регистрации свечения. Такое усовершенствование делает реальным проведение измерений замедленной флуоресценции в полевых условиях. Наряду с использованием уже имеющейся полевой аппаратуры для регистрации переменной флуоресценции, это придаст люминесцентным методам комплексный и более объективный характер.

- Л -

Цель и задачи. Целью работы явилось развитие теоретических основ замедленной флуоресценции хлорофилла как показателя функционирования фотосинтетического аппарата, его чувствительности к стрессовым воздействиям, а также разработка общих методических подходов фотолюминесцентного анализа устойчивости и продуктивности растении. Ь связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать современное состояние проблемы и обобщить имеющиеся литературные данные в рамках развиваемой теоретической концепции замедленной флуоресценции.

2. Выяснить механизм возникновения замедленной флуоресценции в миллисекундном интервале кривой затухания, доступной" для регистрации при помощи наиболее распространенных и простых технических средств.

3. Изучить явление светоиндуцированнш изменений замедленной флуоресценции в его взаимосвязи с переходными процессами фотосинтеза.

4. Установить связь количественн: л параметров замедленной флуоресценции с фотосинтезом, в первую очередь с транспортом электронов и величиной мембранного, потенциала. Исследовать, как реализуется эта связь при изменении таких факторов как свет, температура, содержание воды в листе.

Ь. Определить параметры замедленной флуоресценции, связанные с продуктивностью и устойчивостью фотосинтетического аппарата к стрессу, оптимальные-условия их измерения, природу межвидовых и межсортовых различий этих параметров.

Научная новизна. В широком диапазоне условий у различных фо-тосинтезирующих объектов измерены амплитуды и времена жизни 200--микросекундного и миллисекундного компонентов затухания замедленной флуоресценции, индукционные изменения этих параметров и соотношение квантовых выходов компонентов. Показано, что микросекундный компонент отражает кинетику безизлучательной рекомбинации в реакционных центрах фотосистемы 2 с донорным комплексом в высеем стабильном окисленном состоянии. Миллисекундный компонент в нативных системах происходит в результате обратной реакции между донорами электронов в той же части реакционных центров.

Показано, что в начальный период освещения после переноса 5-6 злйі'троноь и до восстановления пластохинона оборот, фотосистемы

- у -

2 лимитируется реакциями донорной стороны. Выяснено происхождение лимитирующего эвена, предложен новый механизм, объясняющий усиление дезактивации энергии при поглощении света фотосистемой 2 с невыделенной молекулой кислорода.

Впервые показано, что выделение кислорода у хлореллы имеет более быструю кинетику по сравнению с хлоропластами листьев высших растений, в то время как квантовый выход замедленной флуоресценции хлореллы ниже. Дается новое объяснение природы быстрой фазы индукции замедленной флуоресценции, в том числе впервые описанной ее более быстрой субфазы. Детально изучен механизм медленной фазы индукции. Показано, что связь выхода миллисекундного компонента замедленной флуоресценции с мембранным потенциалом тилакоида опосредована внутримембранной разностью электрических потенциалов, выявлены тонкие механизмы этой связи. Установлена роль энерго-пот_г ребляющих темновых ферментативных реакций хлоропласта в формировании медленной фазы индукции.

С использованием растений, выросших в различных световых условиях, изучена видовая специфика параметров замедленной флуоресценции и выявлены особенности структуры фотосинтетического аппарата, лежачие в ее основе. Обоснован количественный показатель для определения эффективности сопряжения световых и темновых реакций фотосинтеза. Показано, что наибольшая эффективность использования мембранного потенциала в темновых реакциях имеет место при полукасы-щающей фотосинтез облученности, обнаружено ее увеличение у тенелюбивых и теневыносливых растєіжй.

Определены параметры замедленной флуоресценции, отражающие влияние факторов, среды на транспорт электронов и мембранный потенциал тилакоидов. Установлено, что ранним ответом на водный ст;^сс является замедление транспорта электронов в фотосистеме I вследствие снижения рН в строме хлоропласта, приводящее к усилению фо-тоингибирования и безиэлучателькых потерь энергии в фотосистеме 2. Показано, что универсальным ответом фотосинтетического аппарата на стресс, является увеличение потребления мембранного потенциала в темновых реакциях. На примере пшеницы установлено наличие внутривидового разнообразия в норме и при стрессе по величине расходования мембранного потенциала. Предложен альтернативный определению скорости фотосинтеза подход для оценки фотосинтетическои и;о-

дуктивности, в этой связи обсуждены причины неудач селекции растений по параметрам фотосинтеза.

Практическая значимость. Выявленные в результате исследований механизмы связи параметров затухания и Светоиндуцированных изменений замедленной флуоресценции могут быть использованы в рамках обратного подхода, то есть- изучения отдельных процессов фотосинтеза и особенностей структуры фогосинтетического аппарата в различных условиях и у различных объектов по данным замедленной флуоресценции. При этом показатели замедленной флуоресценции, отражающие относительную энергизованность мембран, долю мембранного потенциала, расходуемую в темновых реакциях, кинетику лимитирующей транспорт электронов реакции могут быть использованы в качестве сравнительных характеристик фотосинтеза у различных, объектов. В работе определены параметры замедленной флуоресценции и оптимальные условия та регистрации для оценки потенциальной фотосинтетической продуктивности растения в ценозе и его потенциальной устойчивости к стрессу. На основе разработанной методологии совместно с НЛП "Тест" создана базовая автоматизированная модель фосфороскопа для лабораторных исследований и анализа селекционного материала растений, разработана модель устройства для контактных полевых измерений замедленной флуоресценции.

Основные положения, выносимые на защиту.

5. Миллисекундная замедленная флуоресценция растений формируется двумя кинетическими компонентами и происходит в нормально функционирующих реакционных центрах фотосистемы 2 в условиях, когда скорость поступления квантов превышает скорость оборота зтой фотосистемы. Скорость оборота фотосистемы Z лимитируется последним этапом окисления водоразлагающего комплекса.

6. Быстрая и медленная фазы индукции замедленной флуоресценции отражают изменения квантовых выходов различных кинетических компонентов. Кинетика быстрой фазы определяется изменением вероятности состояния фотосистемы 2 с водоразлагающим комплексом в высимм стабильном окисленном состоянии в ходе его ступенчатого окисления и выделения молекулы кислорода. Кинетика медленной фазы индукция определяется лимитирующим транспорт электронов процессом окисления пластохинона в ходе восстановления кислорода и включения цикла фиксации углекислого газа. Влияние мембранного потенци-

ала тилакоида на квантовый выход миллисекундного компонента замедленной флуоресценции в процессе индукции опосредовано внутри-мембранной разностью электрических потенциалов.

3. Максимальное потребление мембранного потенциала тилакоида в темновых реакциях наблюдается при полунасыщающей фотосинтез облученности. У растений в результате Приспособления к росту d условиях недостатка света или селекции высокопродуктивных форм наблюдаются сходные изменения индукционных кривых замедленной флуоресценции, отражающие увеличение потребления анергии в темновых реакциях фотосинтеза. В основе этих изменений лежит перераспределение световой анергии в пользу фотосистемы 2.

4. Наиболее чувствительным к водному стрессу звеном фотосинтеза является транспорт электронов в фотосистеме 1. Вследствие его замедления при уменьшении содержания воды в листе усиливается фо-тоингибирование и безизлучательные потери энергии в фотосистеме 2.

Ь. Оптимальной для определения фотосинтетической продуктивности и чувствительности фотосинтеза к стрессовым воздействиям является регистрация индукции замедленной флуоресценции при полунасыщающей фотосинтез облученности.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены и обсуждены на 6 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Львов, 1980); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1902); Всесоюзной конференции "фогосингетическое выделение кислорода" (Пущино, 1983); Всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 19ъ4); Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма азота и углерода при фотосинтезе" (Пущино, I98b); Всесоюзном сбвещании "Люминесцентные катоды исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности" (Минск, I98b); b Всесоюзной конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987); Всесоюзной конференции "Структурная динамика' биологических' мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторних процессов" (Минск, 1988); 2й l/билейноы совещании и симпозиуме стран СЭВ "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата в связи с преобразованием солнечной энергии" (Толбухин, 1988); Международной школе "Электромагнитные поля и биомембраны" (Плевен, 1989); Всесоюзном совещании "Спектральный состав света и продукционный процесс в упранля>. гмх

условиях" (Красноярск, 1990); Всесоюзной школе-семинаре "Биотер-мохемилюминесценция" (Суздаль, 1990)( Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991); 37 Практической конференции биомедицинского общества "Молекулярная и структурная основа регуляции фотосинтеза" (Лондон, 1991); Научном семинаре отдела биофизики лаборатории Хойгёнса Лейденского университета (Лейден, I99I)) Ib-20 Конференциях молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва, 19В4-1990) и.других конференциях.

Результаты диссертационной работы изложены в ЛЬ публикациях в журналах Биофизика, Физиология растений, Биологические мембраны, Photoeynthetica и других изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, общих выводов и списка литературы (По названий работ на русском и 235 на английском языках); включает 103 рисунка, 4 схемы и 7 таблиц. Полный объем диссертации - 306 страниц, текста (без списка литературы) - 220 страниц.