Введение к работе
Аісгуа.іьїкісїї» проблемы. Одном in основных іенденпнп современно медицины та последние 20 леї является рокое расширение числа клпник< диагностических методой, сопряженное с автоматизацией и компьютерн записі поскольку это обеспечивает -эффективное.ь и быстроту получения информацп о состоянии здоровья паннентон [Ю Л.Владимиров, 1987; Ю.М.Лопухпп н др 1978; К).М Лопухин. 1984]. В частности, п в России и за рубежом все больші распространение получают методы. основанные па пзмеренп хемплюмппесценцин (XJI) биологических жидкостей и клеток организм [Ю.А.Владнмпров и др., 1983; F.McCapra ct al., 1985; B.Rulh, 1979: C.Smitl 199(1]. Проведение таких исследований отличается быстротой п удобство [G.Barnard el al., 1985; W.Seitz сі al., 1985; К.Van Dyke, 1985]; в то же время с и помощью можно решать практические задачи общего клпнпко-лабораторног обследования, в том числе проводить диагностику некоторых заболевани [L.Kricka et al., 1986; H.Meighen el al.. 1985; M.Pazzagli et al., 1985] профилактическое обследование больших контингентов населенії ПО.М.Лопухин и др., 1982; Y.Vladimirov. 1986]. Высокая специфичное! некоторых хемнлюмпнесцеитных методик позволяет применять их для анализ активности ферментов и их субстратов [В.С.Данилов и др., 1981; W.Bostick і al., 1985; B.Branchini et al., 1985]. Кроме этого привлекательными качествам являются простота и сравнительная дешевизна аппаратуры [G.Pekoe, 198. K.Van Dyke. 1985; J.Wampler. 1985].
В большинстве исследований, посвященных использованию ХЛ в клиник-'
метод измерения ХЛ до настоящего времени применяли в качестЕ
биохимического или иммунологического теста: 1) Как одну из разновидносте
биохимического анализа для определения концентрации определенны
веществ: гормонов, антител, антигенов - метод пммуннофермеитного анализ
[W.Bostick et а!.. 1985; T.Gorimar. 1985; KAVulff, 1985]. 2) Для оценки состоят)
рецепторнон системы фагоцитирующих клеток - хемилюминесценци
стимулированных клеток [А.А.Барсуков и др.. 1983; 1986: В.МЗемсков. 1985
Вместе с тем осталось вне рассмотрения применение хемилюмннесцентног
метода как одного из направленні! клинического лабораторного анализа дл
изучения стюбоднораднкальных реакций. Между тем исследование ХЛ, наряд
с методами электронного парамагнитного резонанса
спектрофотометрическимп методами [Ю.А.Владимиров и др., 1991], относится одним из основных инструментов изучения свободнорадпкальных реакций биологических системах [Ю.А.Владимиров н др., 1972; П.П.Иванов и др., 1972 Как способ регистрации свободных радикалов хемилюминесцентнын мето чувствительнее большинства других используемых методов: электронног парамагнитного резонанса, НСТ-теста [О.В.Лебедева и др., 1986; F.Gorus et al 1979; L.Kricka et al., 1982].
Надо отметить, что в последнее время появился ряд сообщений применении ХЛ, связанной со свободнорадпкальпыми реакциями, для оценк состояння больных при различных заболеваниях [А.Н.Журавлев, 1972; 197. А.П.Журавлев и др., 1975]. Были проведены систематические нсс.тедованп перекпенон ХЛ (ПХЛ) [А.К.Журавлев и др., 1988; Я.И.Серкпз и др., 1981]
железошпніииронанной XJI (ЖХЛ), используемой для оценки состояния больных при заболеваниях ночек и острых воспалительных заболеваниях органов брюшной полости [Р.Р.Фархутдпнов. 1984: Р.Г.Фатнхов и др., 1977; Ю.Л.Федоров, 1974]. Изучалась ХЛ стимулированных клеток [R.Allen ct al.,1972; 1976; R.Allen, 1986], использовалась ХЛ в присутствии перокспдазы для определения антпоксндантноп активности биологических жидкостей [Т.Whitehead, 1994]. В каждом из этих исследований был использован какой-либо один метод и не было проведено сопоставление с другими хемплюминеснентнымп методами. Кроме того, в ряде случаев не были решены такие вопросы, как простота п быстрота измерения ХЛ. не удалось добиться достаточной чувствительности, и для анализов требовалось использовать большие объемы крови.
Цель н задачи исследования. Целью работы было систематическое изучение ХЛ плазмы, клеток крови и некоторых биологических жидкостей для оценки состояния больных при различных заболеваниях, а также определение антпоксндантноп активности плазмы крови этих больных хемилюминесцентнымп методами. Решение такой задачи предполагает адаптацию существующих методов регистрации ХЛ к условиям клиннко-лабораторного анализа. Такая адаптация включает в себя: 1. Уточнение механизма реакций. 2. Упрощение процедуры измерения ХЛ. 3. Уменьшение количества требуемого для анализа материала. Основное внимание в наших исследованиях было уделено повышению чувствительности методов для уменьшения объема пробы крови и се составных компонентов; были поставлены также эксперименты, направленные на уточнение механизма наблюдаемой ХЛ в тех случаях, где оказалось это возможным.
В процессе данного исследования решались следующие конкретные задачи:
1.Разработка методик клинико-лабораторного анализа, основанных на регистрации хемнлюмпнесценцин плазмы крови в присутствии двухвалентного железа, и их применение для оценки _ состояния больных с пшерлипопротендемнями.
2.Разработка методик оценки ашнокислптсльной активности (ДОА) плазмы крови и лекарственных препаратов, основанных на ингибпровании железопнмцпированпой хемнлюмпнесценцин модельных систем. и использование измерений АОА плазмы крови для оценки состояния больных гипертонической болезнью.
3.Разработка методик клпнпко-лабораторного анализа, основанных на регистрации хемнлюмпнесценцин биологических объектов в присутствии перекиси водорода, и использование ІІХЛ для оценки состояния больных острыми сосудистыми заболеваниями.
4.Разработка методик клинико-лабораторного анализа, основанных на регистрами!! хемплюмннесцепппп цельной крови и слюны, и их применение для определения активности фаюцшов у і руины больных с различными воспалптелыплми заболеваниями.
5.Разработка па основании полученных данных паучпо-иракіическнх рекомендации к применению каждою из перечисленных хе.мпдюмппеецсшпых меюдо» в к.шплко-.табораюрных исследованиях.
Научная понігліа работы. Показано существование дв\
ХЄМШ1ЮМІПІССЦЄІІ 1 ПЫХ рсаКЦІІН lipll ПереКИСІ ЮМ ОІСІІСЛеїШН ЛІІІ11ІДОІ
инициированном двухвалентным железом. Обнаружена лкінваппя красшелям родамином Ж и нильским сипим хемилюминеспешпш лнпидсодержаїші биологических объектов, включая плазму крони. При 'ггом усилені интенсивности свечения в ряде случаев достигало 30-35 pas. Покачано, чт методики регистрации собственной и активированной же.тезоиннцнпрованно хемплюмппесцспиип можно использовать для оценки степени тяжесі состояния больных и степени выраженности патологического процесса пр гинерлипопротендсмиях н воспалительных заболеваниях, и частности, пр остром перитоните.
Разработана методика измерения железоиннцнпрованно
хемилюмпнеспенции для оценки антнокендантных свойств плазмы крови, также манннта, этанола и понола (разрабатываемых и уже используемых качестве лекарственных препаратов). Показано изменение аигиоксидантны свойств плазмы кропи больных гипертонической болезнью.
В качестве метода оценки состояния системы свободнораднкалыюго пут разложения перекиси водорода была предложена регистрация перекисно хемилюмпнеспенции плазмы крови и раневого экссудата. Показано увеличен! ПХЛ при тромботнческом состоянии гемостаза.
Разработана методика регистрации люминолзавпепмо
хемилюмпнеспенции лейкоцитов, стимулированной кристаллам
труднорастворимых солен. Было показано, что степень увеличения вспышк хемнлюмннесценцип коррелирует со степенью выраженности воспалнтелыгог процесса; это позволяет использовать данную методику для диагностик стадий и фаз в течении заболеваний, а также для контроля за эффективность) лечебных мероприятий.
Теоретическая значимость работы. Показано существование дв\
хемилюмпнесцентных реакций, протекающих при развити
железоинпцнировашгой ХЛ липидсодержапшх систем. На основанії полученных экспериментально-клинических данных обосновывается нове направление в проблеме клпнпко-лабораторного анализа для диагностик заболевании. Показана принципиальная возможность использования комплекс хемилюмпнесцентных методов в клинике. Использование метода регистрами ХЛ показало, что при заболеваниях человека и животных услови возникновения свободных радикалов и уровень свободнорадикальных реакції могут значительно изменяться, восстанавливаясь до уровня нормы в хо; лечения. Проведено изучение особенностей свободнорадикальных процессов организме при различных заболеваниях.
Практическая значимость работы. Разработаны новые направления неспецифическон и прогностической диагностике заболеваний, основанные и изменении различных видов ХЛ, пригодные для таких нозологических єдиній как атеросклероз, воспаления, острые сосудистые заболевания. Получеинь представления о протекании свободнорадикальных процессов в организм были использованы для разработки практических мероприятий, к которы относятся диагностика, коррекция лечебных воздействий, оценка физике
химических свойств лекарственных препаратов, рекомендации по разработке способов лечения. Использование хемплюмннесцентных методик диагностики для коррекции свободнорадикального статуса больных позволило снизить частоту осложнений в течении заболеваний и повысить эффективность лечения больных.
На основе разработок хемплюмннесцентных методик диагностики и оценки состояния систем гомеостаза разработана специальная хемилюминесцентная измерительная аппаратура. Разработаны и изготовлены в виде малой серии средства обеспечения проведения хемилюмннесцентного анализа, в частности, эталон хемилюминесценции СФХМВ-1 в количестве 65 штук. Эталон является уникальным изделием, не имеющим аналогов в мировой практике.
Измерение активированной родамином Ж железонннцинрованной хемилюминесценции сыворотки и плазмы крови позволяет выявлять больных с гиперлипопротеиденями и проводить объективную оценку тяжести нарушений перекисного гомеостаза у больных. Измерение антиокислптелыюп активности сыворотки и плазмы крови позволяет выявлять нарушения в системе антиоксидантной защиты у больных с ннфекционно-воспалительными заболеваниями 11 осуществлять контроль за эффективностью проведения лечебных мероприятий.
По результатам исследований разработаны способы диагностики, защищенные авторскими свидетельствами: I. А.с. № 694181 "Способ дифференциальной диагностики инфаркта миокарда от стенокардии''. 2. А.с. № 1118353 "Способ диагностики фаз в течении острого перитонита''. 3. А.с. № 1194396 "Способ дифференциальной диагностики инфаркта миокарда от хронической пшемической болезни сердца". 4. А.с. № 1209175 "Способ прогнозирования течения репаративного процесса в ране". 5. А.с. № 1285900 "Способ диагностики злокачественной опухоли". 6. А.с. № "Способ выявления сенсибилизации организма при аллергических заболеваниях''. 7. А.с. № 1545160 "Способ определения физической работоспособности человека". 8. А.с. № 1545162 "Способ оценки степени тяжести состояния больного флегмоной". 9. А.с. № 1553900 "Способ прогнозирования неблагоприятного течения флегмоны". 10. Пат. № 2077487 "Установка для очистки сточных вод".
Разработан способ подбора сорбентов и оценки эффективности гемо- и лимфосорбцип при остром панкреатите (рац. предложение № 0-2151 от 16.12.83), способ активации хемилюминесценции плазмы крови в присутствии попов Fe^+ (рац. предложение № 13 от 26.01.88), система регистрации хемилюминесценции ПФХМВ-1 (рац. предложение № 18 от 15.08.88).
Разработанные методики использовались в научно-исследовательской работе и учебном процессе НИИ физико-химической медицины и Российского государственного медицинского университета.
Апробация работы. Основные положення диссертации доложены и обсуждены на: II Всесоюзном сими. "Острая ишемия органов и ранние носпшіемнчссктіе рассіроііетва" (Москва, 1978); Всесоюзном симп. "Липиды биолгпчеекпх мембран" (Ташкент, 1980): Выездном заседании президиума праші. ВІІМОТ (Росюв-на-Дону, 1980); 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982): Паучпо-прак конф. офіальмолої ов 'іаиаднон.
Восточной Сибири и Дальнею Востока "Фішіо.'югия її іннологня механизме адашацпи органа зрения" (Владивосток, 1983); III Всесоюзном сьез; і асіро)іперологоі) (Москва. 1984); Всесоюзной копф. "MB.Ломоносов Север" (Архангельск, 1986); Симпозиуме "Бпохемилюминесцепция в медпціп и сельском хозяйстве" (Ташкент. 1986); XYII сими. Нвропспскоі'о обществ остеоаргрологов (Будапешт. 1988); YI Всероссийском съезде дерматологов венерологов" (Челябинск, 1989); Всесоюзной научной копф. "Оценк фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы (Москва, 1989); Всесоюзной школе-семинаре бпотермохсмилюмипеспенцн (Суздаль. 1990); 1-ой междунар. школе "Биологическое свечение" (Вроцлаї 1990); Всероссийской научной конф. "Эфферентные методы в медицине (Анапа, 1992); Международной коиф. "Клиническая хемплюминесцеццп* (Берлин. 1994); Международной научной коиф. "Школа академик А.П.Черкеса: идеи, развитие, перспективы" (Киев, 199-4): Научно-практическо конф. "Актуальные проблемы военной и экстремальной медицині)!'" (Москв. 1994); Научно-практическом конф. "Организация медицинского обеспечен!) населення в чрезвычайных ситуациях" (Москва, 1994); 2-ом Российском паї конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995); 2-ом снмп. "Неинвазивнь методы диагностики" (Москва, 1995); Объединенной научно-практическо конф. отдела биофизики НІШ физико-химической медицины МЗМП РФ кафедры биофизики Российского государственного медицинског университета.
Результаты работы были удостоены бронзовой медали (удостоверение } 21985 за 1987 г.) На экспозиции в павильоне "Здравоохранение" ВДНХ СССР.
Апробация работы проведена на совместном заседании отдела биофизик НИИ физико-химической медицины МЗМП РФ и кафедры биофизик Российского государственного медицинского университета (1996 г.). По тем диссертации опубликовано 78 печатных работ, включая 4 отдельные книги.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Показано существование двух хемилюминесцентных реакций пр перекненом окислении лпппдов, инициированном двухвалентным железо х Первая является кнелородзавненмой, протекает в липидной фазе и, пс видимому, связана с рекомбинацией перекпсных радикалов лпппдов. Вторг протекает в условиях низкого потребления кислорода и в основном в водно фазе.
-
Инициированная ионами Fe:+ хемнлюмішесценцня лнпидсодержащи объектов, включая плазму крови, можег быть усилена в 30-35 раз красителям родамином Ж и нильским синим, которые действуют как фпзическі активаторы хемилюминесценцпи.
-
Регистрация собственной и активированной жслезопниципрованно хемилюминесценцпи может быть использована для оценки степени тяжест состояния больных и степени выраженности патологического процесса пр пшерлнпопротепдемиях и воспалительных заболеваниях, в частности, пр остром перитоните.
4. Измерение кинетики железошпщнированноП хемилюмипесцеицн
липопротеидов яичного желтка позволяет определить антиоксидантну!
активность плазмы крови п ее составляющих частей, различных соединений, включая используемые в качестве лекарственных препаратов. Было показано, что при аппендиците происходит существенное подавление системы антиоксидантної! защиты в плазме. С другой стороны, развитие осложнений при гипертонической болезни сопровождается увеличением антнокислнтелыюп активности плазмы крови.
5. В качестве метода оценки состояния системы свободнораднкального пути
разложения перекиси водорода была предложена регистрация перекпсной
хемнлюминссценцин плазмы крови и раневого экссудата. Было показано, что
при тромботическом состоянии гемостаза происходит повышение
интенсивности перекпсной хемплюминесценции плазмы, указывающее на
усиление процессов свободнораднкального окисления із организме больных с
этими сосудистыми заболеваниями. Было также обнаружено снижение
перекпсной хемплюминесценции раневых экссудатов по мере заживления ран и
предложено использование данной методики для контроля за эффективностью
лазеротерапии ран.
6. Разработана методика регистрации люминолзависимой
хемплюминесценции лейкоцитов, стимулнровапнной кристаллами
труднорастворимых солей. Было показано, что при воспалительных и гнойно-
воспалнтельных заболеваниях интенсивность стимулированной сульфатом
бария вспышки люминолзависимой хемплюминесценции цельной крови выше,
чем в норме; при этом степень увеличения вспышки хемплюминесценции
коррелирует со степенью выраженности воспалительного процесса.
7. Разработанные методики могут быть использованы в качестве
дополнительного показателя при постановке диагноза и оценке состояния
больных, а также для контроля за эффективностью проводимых лечебных
мероприятий.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 331 страницах машинописного текста, состоит из введения, ^четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа содержит 15 таблиц и 101 рисунков. Библиографический указатель литературы включает 247 отечественных и 263 иностранных источников.