Введение к работе
Актуальность темы
Исследования физико-химических свойств белковых макромолекул продолжают быть в центре внимания исследователей, работающих в самых разных областях: молекулярной биологии, биофизики, цитологии и других биологических дисциплин. Причина кроется прежде всего в том, что долгие годы исследований белков пока не привели к решению основного вопроса физики белка - проблемы построения белка по последовательности аминокислот. Более того, сейчас, более чем раньше, эта проблема кажется далекой от разрешения, так как стало очевидпым, что статистические подходы (основанные на принципах математической статистики и статистической физики) не могут быть использованы для принципиального решения этого вопроса. Таким образом, белковая инженерия, на бурное развитие которой рассчитывает современная фармакология, остается пока без теоретической основы.
Тем более важным представляется изучение физических характеристик белковых макромолекул, их связи со структурой и влиянием на них физических свойств индивидуальных аминокислот. Последнее время особенно активно развиваются исследования электростатических свойств белковых макромолекул, наибольший интерес среди которых вызывают расчеты распределения электростатического потенциала в трехмерной структуре макромолекул. Эти данные позволили предсказать рК ионизации большинства ионизующихся групп в белках, продемонстрировать, как распределение потенциалов и их градиентов может прояснить некоторые, до сих пор непонятные проявления физико-химических свойств и функциональной активности белков.
В расчетах электростатического потенциала по уравнению Пуассона -Болыгмана или в любом другом приближении есть та сложность, что его величина несомненно зависит от параметров среды, упорядочение которой приводит к необходимости знания ее структурных параметров. Совсем уже трудно учесть возможные места посадок ионов, локализация которых всегда затруднена.
Вместе с тем, белки, являющиеся полиамфолитами, в целом ряде процессов выступают как постоянные диполи, т.е. играют роль асимметричного фактора, определяющего ориентацию белка или отдельных его участков в
пространстве клетки. Постоянные дипольные моменты белков могут играть важную роль процессах связывания кофакторов и субстратов в ферментативном катализе.
Очевидно, однако, что в реальных процессах в клетке среда играет важную, едва ли не определяющую роль. При этом ее основа - белок - всегда играет роль структурообразующего фактора, но он может играть роль и асимметрнзующего фактора не за счет внешних зарядов, возникающих при ионизации боковых радикалов, so за счет суммарного дипольного момента, возникающего как следствие парциального заряда атомов при общем нейтральном состоянии макромолекулы. Удивительно, но до сих пор не было проведено систематического исследования дипольных моментов белков в нейтральном приближении. Вместе с тем именно при анализе роли электростатики в структурообразовании белков и их функционировании в первую очередь должны быть предприняты исследования распределения дипольных моментов в пространственных структурах глобулярных белков.
Распределение дипольных моментов связано также и с важнейшей особенностью динамики белковых глобул - существованием так называемой сегментарной подвижности в белках. Данный тип подвижности отражает наличие в макромолекуле энергетически сильно связанных участков. Дипольные моменты таких энергоемких сегментов могут играть важную роль в процессах структурообразования и функционирования мультидоменных белков.
Наконец, распределение дипольных моментов в третичной структуре глобулярных белков играет серьезную роль во взаимодействии глобулярных белков с водой. Вода - полярная молекула, ее взаимодействие с белком может приводить к нейтрализации некомпенсированных зарядов и, соответственно, уменьшению общего дипольного момента макромолекулы. Однако, организация гидрагной оболочки с упорядоченными сетками воды может приводить к более сложным распределениям остаточных зарядов. Эта проблема важна для оценки роли воды в процессах белок - белковых и белок - нуклеиновых взаимодействиях.
Наконец, образование комплексов макромолекул - этот, едва ли не самый важный, процесс, сопутствующий функционированию большинства макромолекул, несомненно опирается на их дипольные свойства.
Перечисленные выше примеры роли асимметричных факторов в структуре и функционировании белков и их комплексов свидетельствуют о
серьезной актуальности проблемы анализа распределения дипольных моментов в третичной структуре белков именно в нейтральном приближении.
Цели и задачи исследования
Целью данного исследования было изучение распределения дипольных моментов в третичной структуре глобулярных макромолекул и их комплексов в нейтральном приближении. В качестве объектов предполагалось использовать все белки с надежно установленной трехмерной структурой из балка пространственных структур (PDB).
Задачей исследования было:
-
Изучение зависимости суммарных дипольных моментов белков от их молекулярного веса.
-
Анализ зависимости распределения дипольных моментов в белках от типа пространственной структуры. Поиск связи между распределением дипольных моментов и распределением аминокислотных остатков в структурах гомологичных белков.
-
Анализ влияния воды на дипольные моменты белков. Сравпепие с фрактальными размерами.
-
Установление связи между доменной структурой и распределением дипольных моментов.
-
Распределение дипольных моментов в белок - белковых и ДНК - белковых комплексах.
Научная новизна работы
Впервые создан исследовательский метод ( с комплексом программ для пользователей ) расчета распределения дипольных моментов ( в нейтральном приближении ) в пространственных структурах глобулярных белков. Метод включает обоснование использования нейтрального приближения для расчетов распределения дипольных моментов белков, в него входит обоснование иерархического способа нейтрализации зарядов на элементах структуры глобулярных белков, а также комплекс программ для расчетов и анализов распределения дипольпых моментов в третичных структурах глобулярных белков и их комплексов. Комплекс программ включает расчет карт
распределения дипольиых моментов с их графическим представлением, в двумерном и трехмерном видах. Создан комплекс графических программ, включающий трехмерные изображения атомных структур белков с указанием распределения физико-химических характеристик отдельных участков белков, а также изображения направлений дипольиых моментов в любых частях трехмерной структуры глобулы.
Графический способ построения двумерных карт включает в себя изображение цветом определенных интервалов значений физических характеристик отдельных определенных участков белка или (по заданию) суммарных дипольних моментов модулей, доменов, субъединиц или комплексов белков, ДНК и т.д.
В комплекс программ входят также различные способы одномерного графического представления свойств биополимеров и их комплексов, что позволяет, например, поставить в соответствие дипольные моменты тем аминокислотным последовательностям, которые их определяют. С помощью разработанного метода:
-
Впервые рассчитаны дипольные моменты более чем для 4100 белков из PDB-банка. В отличие от принятых способов составления белковых выборок мы учли все белки (в том числе и белки одного наименования, структура которых определена в различных комплексах) в силу того, что дипольный момент белка (даже в нейтральном приближении) серьезным образом зависит от конформациогшого состояния боковых радикалов. Последнее впервые продемонстрировано нами на примере лизопима фага Т4: показано, что в этом белке замена Glyl05 на АЫ05 приводит к изменению дипольного момента вдвое и что причиной этого является изменение конформации боковых радикалов при сохранении конформации пептидных групп.
-
Проанализирована зависимость дипольного момента белков от длины молекулярной цепи. Показано, что максимальное значение дипольного момента возникает в белках, содержащих около 450 аминокислотных остатков. С дальнейшим увеличением длины цепи максимальное значение дипольного момента падает. Причем дипольный момепт мультидомепных белков приближается к значению, соответствующему величинам не болыпим,чем максимальные дипольные моменты белков с ~ 50 - 100 аминокислотами. Таким образом, структура мультидоменных белков
образуется при минимизации суммарных динольных моментов доменов мультидоменного белка.
-
Показано, что суммарный дипольный момент белков минимизируется с увеличением в них количества Р-структуры, начиная примерно с 20%-ого ее содержания. Минимизация дипольных моментов а-спиральных белков начинается с 50% содержания а-спиралей.
-
Проанализирована роль гидратной воды в организации поверхности глобулярных белков и показапо, что в отличие от ожидаемого, вода только незначительно уменьшает фрактальный коэффициент поверхности глобулярных белков. В то же время дшгольные моменты белка с водой растут в большинстве исследованных случаев. Изучены все случаи, когда различными методами, в том числе и нейтронографии, установлены координаты атомов водорода воды. Полученные результаты означают, что гидратная вода, являясь частью физической структуры белка, усиливает асимметрические свойства белков.
-
Показано, что на границах домепов суммарный дипольпыи момент изменяется, указывая на роль электростатики в их формировании.
Апробация
Результаты диссертации докладывались международной конференции по химической термодинамике, Осака, Япония, 1996 и на международной школе "Проблемы теоретической биофизики", Москва, 15-20 июня 1998.
Публикации
По материалам работы опубликованы шесть статей и тезисы.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Дипольный момент белка зависит не только от конформации пептидных групп, но и от конформационного состояния боковых радикалов.
-
Максимальным значением суммарного дипольного момента характеризуются белки, содержащие около 450 аминокислотных остатков. Структура мультидоменных белков образуется при минимизации суммарных диполышх моментов отдельных доменов.
-
Гидратная вода, являясь частью физической структуры белка, усиливает асимметрические свойства их макромолекул.
4. Распределение дипольних моментов в пространственной структуре белков играет важную роль в процессах формирования доменов.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 129 страницах и включает 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы содержит 103 наименования. Диссертация состоит из введения и семи глав, заключения, выводов и списка литературы.