Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время тесная связь между перекисным окислением липидов (ПОЛ) и активностью клеточных мембран, более того, определяющая роль ПОЛ в проявлении биологической активности не вызывает сомнений. При этом ПОЛ обычно рассматривается как универсальный процесс, ответственный за повреждение мембран.
Современная стадия изучения ПОЛ в биологических системах во многом предопределена работами Б.Н. Тарусова, сформулировавшего в середине 50 г.г. гипотезу о решающей роли цепной реакции свободно-радикального окисления липидов при действии на клетку повреждающих факторов. Из работ Б.Н.Тару-сова и его школы следует, что повреждение мембран клеток и клеточных орга-нелл - это один из универсальных патологических процессов.
В настоящее время наблюдается усиление интереса к исследованию роли кислородных радикалов [Скулачев В.П. 1995] и к радикальным процессам, протекающим в биологических мембранах. Наибольший интерес в этом случае представляют мембраны эндоплазматического ретикулума и мембраны митохондрий. Первые осуществляют гидроксилированне ксенобиотиков, вторые -синтез АТР, Наличие в мемранах митохондрий и микросом редокс-цепей, способных генерировать активные формы кислорода, и взаимодействие последних с ненасыщенными жирными кислотами фосфолипидов приводит к переносу радикального состояния на липидные молекулы, т.е. к образованию липидных радикалов, а затем и липидных перекисей.
При выяснении роли ПОЛ, на наш взгляд, прежде всего следует иметь в виду- интенсивность этого процесса. Оценивая степень интенсивности ПОЛ можно выделить три качественно разных случая: интенсивное, умеренное и слабое ПОЛ. Слабое ПОЛ характерно для раковых клеток; умеренное ПОЛ можно рассматривать как нормальный, строго контролируемый in vivo процесс. Интенсивное ПОЛ- это уже нарушение структуры и функции мембран и, наконец, патологию можно представить как промежуточное состояние между умеренным и интенсивным ПОЛ.
При выяснении роли радикальных процессов и роли интермедиатов ПОЛ возникает два вопроса: во-первых, всегда ли образование радикалов ведет к образованию липидных гидроперекисей и имеют ли радикальные процессы значение для функционирования биологических мембран в норме; во-вторых, каково их влияние на структуру и функции мембран?
Ответ на эти вопросы требует детального изучения гидроксилирования ксенобиотиков в микросомах и окислительного фосфоршшрования в митохондриях и, в частности, изучения влияния на эти процессы соединений, действующих в качестве ингибиторов (антиоксидантов) и промоторов (проокси-дантов) свободно-радикальных реакций.
Механизмы перекисного окисления и действия антиоксидантов на ПОЛ в гомогенных и гетерогенных системах на протяжении многих лет изучаются в таких крупных центрах, как Институт химической физики (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П.,Глущенко Н.Н) Российская медицинская академия (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., Потапенко АЛ.) и Биологический факультет МГУ (Козлов Ю.П., Иванов И.И.,Мерзляк М.Н.). Иными словами, вопросы перекисного окисления литщдов уже почти полвека находятся на пересечении интересов биохимиков и биофизиков, а также специалистов в области физико-химической медицины.
Известно, что в защите биологических структур участвуют два антиокси-данта - убихинон и токоферол и что ключевая роль в обеспечении структурно-функциональной стабильности тшидного бислоя принадлежит а-токоферолу. При рассмотрении проблемы обеспечения надежной работы биологических мембран в различных органах и тканях, это положение не вызывает сомнений. Тем не менее, учитывая особенности функционирования токоферола в биологических мембранах и других биологических структурах (например, в липопро-теидах низкой плотности) по сравнению с химическими (гомогенными) системами следует признать, что механизм действия токоферола остается во многом неясным.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании процессов, связанных с образованием липидных радикалов в ненасыщенных жирных кислотах фосфолипидов, а также в установлении связи между процессом образования липидных (перекисных) радикалов и функционированием биологических мембран в норме.
В соответствии с этим, в работе были поставлены следующие основные задачи, решение которых потребовало проведение экспериментальных исследований в три этапа; во первых
- Исследовать механизмы действия токоферола, обеспечивающего струк
турную стабилизацию искусственных мембран (липосомы) при активации ПОЛ
азоинициатором, а также структурно-функциональную стабилизацию биологи
ческих мембран (микросомы печени) в условиях NADPH-зависимого ПОЛ и
роль цепи ЫАО(Р)Н-цитохром bs.
- Провести исследование синергетического действия ос-токоферола и та
ких восстановителей, как аскорбат и глутатион в микросомах. Исследовать ме
ханизм действия глутатиона, т.е. выяснить является ли синергетический эффект
глутатиона результатом прямого (неферментативного) действия или результа
том работы GSH-зависимого фермента.
Кроме того,
- Изучить инициирование образования липидных (перекисных) ради
калов в микросомах печени и возможность контроля уровня радикалов с по
мощью про- и антиоксидантов, а также возможное влияние про- и антиокси-
дантов на процесс гидроксилирования лилофильного ксенобиотика, полицик
лического углеводорода - бенз(а)гагрена.
Наконец,
Провести детальное исследование редокс-зависимого перекисного окисления липидов в митохондриях печени, т.е. выяснить каковы разичия в интенсивности ПОЛ в митохондриях в различных функциональных состояниях.
Изучить влияние редокс состояния убихинона, контролирующего уровень липидных радикалов в мембранах митохондрий, на процесс синтеза ATP, а
также возможность регуляции фосфорилирования ADP в результате напраї ленного изменения уровня лигшдных радикалов (с помощью про- и антиоксі дантов).
Научная новизна. В диссертационной работе предложен:
1. новый механизм действия биоантиокеиданта - а-токоферола, позвояющи
объяснить его высокую эффективность в мембранах;
Исходя из новой роли токоферола в биомембранах, предложен:
-
механизм преобразования энергии в мембранах макросом; он позволяет об? яснить явление активации "спящих" цитохромов типа Р-450;
-
механизм внутримембранного переноса энергии в мембранах митохондрщ позволяющий объяснить явление decoupling (отключение).
Впервые проведено изучение функционально значимого, т.е. умеренног ПОЛ; установлено, что чем выше функциональная активность, тем ниже урс вень перекисного окисления липидов в мембранах. И наоборот, при работе ре доке цепи вхолостую происходит усиление ПОЛ, которое служит своего род инструментом разборки биологических мембран.
Предложен принципиально новый механизм действия токоферола, ее гласно которому взаимодействие с перекисными радикалами ведет не к образе ванию гидроперекисей, а к восстановлению исходной структуры жирной кис лоты фосфолшшда. Рассмотрены два механизма действия токоферола: нефер ментативный (двухэлектронное окисление токоферола) и ферментативный м« ханизм с участием цепи NAD(P)H- цитохром bs.
Полученные в работе данные свидетельствуют в пользу представлений том, что фосфолшшдная мембрана играет активную роль в преобразовани энергии. Предлагается механизм функционирования липидно-радикальны циклов, которые приводят к появлению лилидных пульсаций в мембранах. Тг кой механизм преобразования энергии обеспечивает ее использование дл ферментативного катализа: гидрокешшрования ксенобиотиков (микросомы) синтеза АТР. Рассматривается модель сопряжения окисления и фосфорилирс
вания, в которой находят свое объяснение не только uncoupling (разобщение), но и decoupling (отключение).
Научно-практическая значимость работы. Данное диссертационное исследование является составной частью программы ГКНТ 0.69.05 и 0.69.07 "Роль структурной организации мембран в их устойчивости и биоэлектрических функциях".
Полученные в работе экспериментальные результаты и теоретические обобщения расширяют представления о механизмах защиты биологических мембран, что позволяет по-новому оценить роль антиоксидантов и открывает новые подходы к проблеме использования природных и искусственных антиоксидантов.
Предложенный в работе УФ-мегод инициирования ПОЛ с помощью азо-инициатора может быть использован для скрининга антиоксидантов на таких моделях как липосомы и липопротеиды низкой плотности, что необходимо в ходе поиска новых соединений данного класса.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Витамин Е (токоферол) обладает универсальным стабилизирующим действием во внутриклеточных мембранах; это действие реализуется при физиологически значимых способах инициирования ПОЛ в биологических мембранах (активации кислородными радикалами).
Механизмы действия токоферола в химических (гомогенных) системах и биологических (гетерогениых) системах различны. Результат взаимодействия токоферола с липидными (перекисными) радикалами в биологических мембранах может быть иной, чем в гомогенных системах. При взаимодействии токоферола с радикалами ЬОг наряду с образованием гидроперекисей LOOH, возможен возврат жирной кислоты в исходное состояние LO2 — LH (в результате замены Ог на Н-атом).
Для оценки роли радикалов необходимо иметь в виду возможность участия интермедиатов ПОЛ(перекиснъгх радикалов) в редокс реакциях. Восстановление радикалов LO2 может происходить в мембранах микросом и мито-
хондрий. В первом случае в реакции LOj -> LOj участвует цепь NAD(P)H- ц> тохром b5, во втором - ферменты редокс-цепи.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на кої ференциях и на научных семинарах; на кафедрах биофизики Биологического Физического ф-та МГУ, в институте биохимии им.А.Н. Баха, в институте хі мической физики им.Н.Н.Семенова, в кардиоцентре РАМН, в институте физи ко-химич. медицины, на конференциях в Москве, Ленин-граде, Киеве, Ереваж Kyoto (Japan), Lion (France).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы центральных академических и международных изданиях.
Методические аспекты работы. В качестве объекта исследования был использованы искусственные мембраны (липосомы), внутриклеточные орга неллы (митохондрии) и мембраны эндогиазматического ретикулума (микро сомы). В работе использовали крыс-самцов линии Вистар, которых содержал: на стандартной диете в условиях вивария.
Митохондрии и микросомы печени выделяли методом дифференци ального центрифугирования; фракции липопротеидов плазмы крови выделял последовательным центрифугированием в солевой среде заданной плотности Однослойные липосомы получали методом озвучивания многослойных липо сом, приготовленных из природных и синтетических фосфолилидов.
Экспериментальное решение поставленных в работе задач потребовал применение набора физико-химических и биохимических (препаративных) ме тодов; основные из этих методов перечислены ниже.
Суммарные липиды из внутриклеточных мембран экстрагировали, ис пользуя стандартную методику (экстракцию смесью хлороформ-метанол). Со держание фосфолилидов определяли по фосфору. Степень восстановленності убихинона в митохондриях определяли после экстракции по поглощению окис ленной и восстановленной форм [Kroger,Klingenberg 1966]. Токоферол опреде ляли по методике [Burton et al. 1985] с некоторой модификацией.
Перекисное окисление лигшдов инициировали ферментативным и неферментативным способом. В ряде случаев использовали азоинициатор Azo-isobutyronitril (AIBN); разработаїшьш нами метод УФ-облучения позволяет использовать этот инициатор и генерировать первичные радикалы при температуре 25-37 С . В частности, при инициировании ПОЛ в липосомах УФ-светом (X 320-380 нм) с помощью AIBN образование первичных радикалов происходит следующим образом:
R-N=N-R N2 + 2R"
Такой способ инициирования ПОЛ позволяет контролировать скорость процесса и в шпщиировании ПОЛ не участвует супероксид.
Содержание лшшдных гидроперекисей определяли по УФ-поглощению диеновых коньюгагов в области 233 нм [Recknagel, Glende 1984]; содержание малонового диальдегида (МДА) - по его реакции с тиобарбитуровой кислотой [Asakawa, Matsushita 1980].
Содержание цитохрома типа Р-450 в микросомах печени определяли по поглощению комплекса с СО [ Matsubara et al. 1976]. Скорость гидро-ксилирования полициклического углеводорода бенз(а)пирена и скорость расходования NADPH определяли методом прямой регистрации флуоресценции этих соединений [Yang,Kicha 1978].
Для генерации супероксида в мнкросомах использовали менадион; в митохондриях - эффект облучения NADPH ультрафиолетом. NADPH -> NADPH* и NADPH* + 02 -> NADP+ + Oj Поглощение кислорода регистрировали полярографическим методом с использованием платинового электрода. Мембранный потенциал определяли с помощью селективного электрода по распределению проникающего катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) [Kamo et al. 1979].
Скорость сігятеза ATP оценивали тремя независимыми методами: ферментативно с помощью гексокиназы, глюкозы и глюкозо-6-фосфат-дегидро-геназы [Lamprecht, Trantschold 1974], либо контролируя длительность фосфори-
лирования ADP по величине мембранного потенциала, а также полярографи1 ски, определяя отношение ADP/0.