Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одно из центральных мест з современной биофизике занимает исследование К+-каналов, присутствующих в клеточных мембранах большинства организмов. Поскольку токсины скорпиона являются специфическими ингибиторами К+-каналов, то они используются в качестве инструмента для их изучения. Причем исследования проводятся как на хорошо изученных белках, так и на недавно обнаруженных. Токсины скорпиона используются для изучения двух типов К+-каналов: потенциал-зависимых и -Са2+-зависимых. Особый интерес представляет выяснение механизма специфичности действия токсинов скорпиона на различные К+-каналы. Необходимой основой для этих исследований является установление" пространственной структуры токсинов и анализ нх структурно-функциональных взаимосвязей.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы являлось 1) установление пространственной структуры токсина OSK1 из яда скорпиона Oithochirus scrobiculosus методом 'Н-ЯМР, 2) изучение структурно-функциональных особенностей OSK1 и коротких токсинов семейства скорпиона и 3) проектирование пространственной структуры "универсального'' блокатора К+-каналов. Научная новизна и практическая ценность работы.
В данной работе впервые получена пространственная структура токсина OSK.1 в водном растворе, используя данные 'Н-ЯМР экспериментов и метод дистанционного геометрического алгоритма. Анализ вторичной структуры токсина показал, что он имеет аУр-тип укладки полипептидной цепи в пространстве. Кроме того выявлен ряд существенных деталей пространственной структуры OSK1, таких как солевой мостик в га-спирали, N- и С-концевые "шапочки", конформационная дисперсия в дисульфндных связях, подвижность (5-поворота и некоторых боковых цепей. Показана корреляция участия аминокислотного остатка в связывании с рецептором и его подвижностью. Полученные результаты позволяют лучше понять связь структуры и функции токсинов скорпиона. .
Впервые для идентификации структурных и функциональных остатков токсинов семейства скорпиона применен метод МГП. Кроме того получена наиболее устойчивая к мутациям аминокислотная последовательность UTX, обеспечивающая привнесение в его пространственную структуру наиболее сильных взаимодействии (как стабилизирующих так и функциональных) из присутствующих в семеіістяе токсинов скорпиона. Разработанные подходы позволяют синтезировать
токсин UTX, более стабильный и с более широким спектром действия на К+-каналы по сравнению с природными гомологами.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались на 4-м Всесоюзном семинаре но ЯМР-спектроскошш, посвященном памяти В.Ф. Быстрова, Москва, декабрь 1995 г.; 13-й Европейской Конференции "Экспериментальный ЯМР", Париж, Франция, май 1996 г.; 3-х Чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, ноябрь 1996 г.; 9-й Зимней студенческой научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, февраль 1997 г.
Структура диссертации.
-Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 35 рисунков и состоит из введения, грех глав, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 146 наименований. В конце диссертации приведены табличные данные и сокращения.
Использованные сокращении.
PDB (Protein Data Dank) - Брукхэйвенский банк белковых структур; OSK1 - токсин скорпиона Orthochirus scwbkulvsus ; UTX - "универсальный" токсин скорпиона; SXM - поксиустокшн; ChTX - харибдотокешг, MgTX -марготоксин; AgTX - апютоксин; КТХ - калпотоксин; K.V - потенциал-зависимые К+-каналы; ВК (или muxi).- Са"+-зависимые К+-каналы высокой проводимости; DQF-COSY - корреляционная, спектроскопия с двухквантовым фильтром; TOCSY - тотальная корреляционная спектроскопия; ЯЭО (МОЕ) '- ядерный эффект Овехаузера; NOESY -двумерная спектроскопия ЯЭО; r.m.s.d. - средне-квадратичное отклонение; МГП - молекулярный гидрофобный потенциал; PSC - коэффициент соответствия гндрофобности остатка его окружению.