Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Разработка современных представлений о функционировании живых систем независимо от уровня их организации невозможна без характеристики особенностей одного из фундаментальных процессов-энергетического метаболизма. Отличительной особенностью знергетикиї является ее запрограммированность на поддержание постоянной концентрации АТФ, что, в первую очередь, обеспечивается изменением скоростей метаболизма. Поэтому полное описание процессов производства и потребления энергии в живой системе должно включать в себя сведения о концентрациях метаболитов, участвующих в энергетическом обмене, данные об их динамике и характеристики взаимосвязанаости метаболических превращений. Неискаженные сведения могут быть получены только в неинвазивных исследованиях. Перечисленные требования необходимо учитывать при выборе экспериментального метода исследования. Им удовлетворяет метод ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения, позволяющий за малый промежуток времени определять качественный и количественный состав метаболитов, их компартменгализацию, кислотность внутриклеточной среды в биологических объектах прижизненно.
Несмотря на успехи ЯМР - спектроскопии живых систем Сих свидетельством является то, что за 15 лет своего существования метод развился в самостоятельное направление исследований, результаты которых в настоящее врекя используются в практической медицине), возможности метода еще далеко не изучены и не исчерпаны. Помимо требующих решения технических проблем С повышение чувствительности, пространственного и временного разрешения), важнейшей задачей остается накопление информации о метаболических процессах и их регуляции б живом организме. Необходима разработка методов адекватной интерпретации данных и способов сопоставления метаболизма и функции. Сложность организации метаболизма в организме ставит задачу поиска экспериментальных моделей, позволяющих исследовать эффекты разных урознсй с том, чтобы выявить причины нао'лвлаемих in vivo процессов. Изучение особенностей функционирования и регуляции энергетического обмена при таких патологиях, как
злокачественные опухоли, нарушение мозгового кровообращения и лучевая болезнь, представляет собой важную биомедицинскус задачу. Требуются данные in vivo о метаболических нарушениях в процессе развития патологий и в результате терапии, которые дают принципиально новую информацию, без чего невозможна разработка современных методов диагностики и лечения.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Настоящее исследование посвящено поиску новых возможностей метода ЯИР - спектроскопии в научении энергетического метаболизма, выявлению параметров, характеризующих энергетический статус и его изменение при патологических состояниях, разработке соответствующих экспериментальных подходов и способов анализа данных для исследования энергетического метаболизма живых систем. Основное внимание уделено изучению особенностей метаболизма фосфатов - участников энергетического обмена в условиях in vivo. оценке специфичности и внутрипопуляционной вариабельности энергетического метаболизма при патологических состояниях, выявлению связи между метаболическими и функциональными нарушениями. Такого рода аадачи ставились впервые, возникая параллельно с расширением инструментальных возможностей метода ЯМР для наблюдения метаболических путей in vivc. Поэтому необходимым этапом исследования было: I -определить, что "видит" метод; 2 - установить, что в "видимом" характеризует патологию; 3 - выбрать чувствительные метаболические характеристики развития патологических процессов; 4 - выявить связь между метаболизмом и функцией. В качестве объектов исследования были выбраны патологии двух типов: опухолевые образования и патологии головного мозга различной этиологии. Выбор . моделей определялся как соображениями практической значимости, так и ролью, которая принадлежит энергетическому метаболизму в развитии этих патологий.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые даны оценки энергетического статуса опухолей, позволившие охарактеризовать энергетические процессы собственно опухолевых клеток и эффекты влияния организма. Полученные результаты позволяют проанализировать уеханизюі отдельных способов противоопухолевой терапич и установить связи между метаболическими сдвигами и
противоопухолевым эффектом. В частности: а) - впервые показано, что особенностью адаптации клеток опухоли к дефициту энергетических субстратов на поздних стадиях опухолевого процесса является увеличение эффективности экскреции лактата во внеклеточную среду и снижение содержания АТФ в клетках; б) - впервые установлено, что противоопухолевые препараты различных молекулярных и клеточных механизмов действия вызывает специфические нарушения фосфатного метаболизма опухолевых клеток, характуризущие особенности прямого действия препаратов на энергетический метаболизм и опосредованные эффекты - через цитокинетические сдвиги; в) -- в лекарственно устойчивых штаммах опухолевых клеток обнаружен метаболический маркер множественной лекарственной устойчивости, обусловленный модификацией липидного метаболизма; г) - впервые 'обнаружено пролонгированное синергическое действие термотерапии и вазодилатации на энергетический статус опухоли In vivo; выявлены пороговые эффекты и определены граничные значения интенсивности кровотока в опухоли, модифицирующие ее энергетический статус и вызывающие задержку опухолевого роста.
Впервые с помошьп датчиков ЯМР с поверхностными катушками специальной конструкции подробно in vivo изучена динамика нарушений и восстановления фосфатного метаболизма мозга при патологических состояниях разной этиологии. Выявлены индивидуальные особенности ответа системы энергетического метаболизма мозга на патологические воздействия, предложен способ выделения групп риска. В процессе этих исследований впервые: аЗ - охарактеризованы нарушения фосфатного метаболизма клеток изолированного мозга в сравнении с показателями мозга in vivo; б) показано, что снижение уровней макроэргических фосфатов в развитии тотальной ишемии имеет бифаэный характер и мокет быть описано суммой двух экспонент с характеристическими временами, различавшимися на порядок. Выявлено дэстовернсе положительное действие блокатора кальциевых каналов верапамила на динамику снижения концентраций макроэргов мозга при тотальной ишемии; в) - впергые обнаружено участие
системы энергетического метаболизма мозга in vivo в процессах компенсации травмы фронтальной коры и механизмах протекторного эффекта экзогенного моносиалоганглиозида GMI, средства коррекции посттравматгческих функциональных нарушений; выявлены индивидуальные характеристики метаболических и функциональных изменений, продемонстрирована их взаимнооднозначная связь.
г). - впервые зарегистрированы нарушения энергетического метаболизма мозга, вызванные компрессией фронтальной коры; д) - впервые изучена индивидуальная динамика показателей фосфатного метаболизма мозга при общем однократном г -облучении в среднелетальнсй и сверхлетальной дозах; обнаружена функциональная зависимость между кислотностью внутриклеточной среды и концентрацией неорганического фосфата при облучении в среднєлетальной дозе; установлено влияние общего т - облучения в сверхлетальной дозе на содержание АТФ з мезге.
Разработан новый подход к анализу энергетического статуса мозга in vivo, основанный на характеристике связанности и сбалансированности параметров энергетической обмена, измеренных методом ЯМР Р in vivo. Предложен способ анализа спектральных данных, выявляющий компенсаторные свойства энергетики мозга как целостной системы. Доказана возможность обнаружения патологических изменений в системе энергетического метаболизма, незаметных для стандартных методов статистической обработки спектральных данных. Предложен количественный критерий оценки энергетического статуса, Z-индекс, более чувствительный чем обычно используемые относительные концентрации фосфатных метаболитов.
С помощью разработанного подхода для ряда патологических восдействий (фронтальная лсбэктомия, компрессионная ишемия, ї-облучєние) выявлено снижение адаптационных возможностей и гомеопатической устойчивости системы энергетического метаболизма мозга. Обнаружена взаимнооднозначная связь между характером изменений Z-индекса и функциональными нарушениями, мекду величиной воздействия и динамикой Z.
В целом предложенные подходы и полученные на их основе
результаты открывают новое направление в изучении энергетического метаболизма биологических систем in vivo.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в работе данные могут служить основой для разработки методов мониторинга роста опухоли в живом организме, создаст возможность быстрой оценки клеточных и молекулярных механизмов действия противоопухолевой химиотерапии, перспективы обнаружения метаболических сдвигов, сопутствующих развитию лекарственной устойчивости, расширяет рамки терапии, основанной на модификации опухолевого кровотока.
Результаты исследований динамики метаболизма ишемической ткани мозга необходимы для разработки теории ишемических состояний, поиска критериев оценки степени тяжести нарушений метаболизма. Обнаруженное защитное действие лекарственных препаратов, снижающих темпы изменений состава фосфатных метаболитов при ишемии или способствующих восстановлению метаболических и функциональных повреждений мозга, необходимо учитывать при терапии. Предложенный метод анализа спектральных характеристик создает основу
нового способа диагностики и прогноза in vivo. Выявленная индивидуальная динамика восстановления энергетического статуса мозга и предложенный критерий'оценки нарушений энергетического метаболизма мозга может использоваться для анализа индивидуальной чувствительности мозга к патологическим воздействиям.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы долояены на 5, 6 и 8 Всесоюзных конференциях "Магнитный резонанс в ' биологии и медицине" (Звенигород, 1985; Одесса, 1986; Звенигород, Г9Э0), 2-й Всесоюзной конференции "Физиология, патофизиология, фармакология мозгового кровообращения" (Тбилиси, 19881, Семинаре фирмы "Вариан" "Прикладная ЯМР-спектроскопия" СМосква, 1990), Европейских конгрессах по ЯМР в медицине и 5иологии (Страсбург, 1990; Цюрих, 1991; Рим, 1993; Вена, 1994;' Прага, 1996), Ежегодных съездах Общества Магнитного эезонанса в медицине (Нью-Йорк, 1990, Берлин, 1992;' Зан-Франииско, 1994; Ницца, 1995), 26 конгрессе Ампера по магнитному резонансу (Афины, 1992), на Учредительном сонгрессе Международного общества патофизиологии CI39I.
Москва), на 12 и 13 Европейских конференциях по экспериментальному ЯМР СОулу, 1994; Париж, 1996), 17 Международном симпозиуме по клинической гипертермии (Павия, Италия, 1994), 2 Международной конференции по биологическим основам индивидуальной чувствительности к психотропным веществам (Москва, 1993), Конкурсах-конференциях ученых ИХФ РАН СМосква, 1992, 1994), Российской научной конференции "Антигипоксапты и актопротекторы: итоги и перспективы" (СгПетербург, 1994), Международном симпозиуме "Физиологические и биохимические основы активности мозга (С.Петербург, 1991), I научно-практической конференции стран. СНГ "Магнитно-резонансная томография в медицинской практике" (Москва, 1995), 9 Конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии (Звенигород, 1996).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 48 печатных работ.
НА ЗАШИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕЛУИІШЕ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. Модельная система клеток асцитных опухолей позволяет свести к минимуму эффекты неоднородности микроциркуляции кровотока в опухоли и обнаруживает специфические сдвиги показатэлей энергетического и лшгадного обмена, выявляющие: '. I-механизмы адаптации клеток к развивающемуся в динамике опухолевого роста дефициту кислорода и глюкозы; 2 -цитскинетические эффекты химиотерапии; 3 — особенности метаболизма, связанные с резистентностью опухоли к химиотерапии. Общие закономерности и специфические особенности ответа показателей энергетического метаболизма клеток асцитных опухолей на действие лекарственных препаратов выявляют клеточные и биохимические механизмы, лежащие в их основе.
Снижение опухолевого кровотока создает пороговый эффект
"дезенергизации" опухоли in vivo. Противоопухолевый эффект
возникает при падении интенсивности опухолевого кровотока до
критической величины и является следствием пролонгированной
ишемии, вызывающей полную "дезэнергизацию" опухоли in vivo.
Сокращение времени регистрации спектров QiP ЯМР in vivo выявляет одновременный бифазный спад фосфокреатина и АТФ в мозге при тотальной ишемии и обнарукивает достоверное
положительное влияние блокирования кальциевых каналов на процессы нарушения энергетики мозга при тотальной ишемии.
Вследствие эффективной регуляции системы энергетического обмена патологические процессы, не связанные с полной ишемией мозга, вызывают слабые специфические сдвиги концентраций фосфатных метаболитов. Нарушения регул.чторных механизмов обнаружены с помощью нового критерия, основанного на учете совокупности корреляционных связей между измеренными методом ЯМР Р in vivo показателями энергетического обмена. Критерий характеризует гомеостатичєскую устойчивость и адаптационные возможности энергетики как системы в целом. Разработанный метод анализа устанавливает взаимнооднозначное соответствие между метаболическими и функциональными нарушениями при травме фронтальной коры, зависимость энергетического статуса от величины воздействия >при общем однократном т-облучении, характеризует динамику восстановления энергетического статуса мозга в компенсаторном периоде после фокальной компрессионной ишемии.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из трех разделов. Данные обзора литературы (раздел 1) характеризуют современное состояние исследований метаболизма живых систем методом ЯМР. Раздел II С7 глав) посвящен изучению энергетического метаболизма экспериментальных опухолей in vitro и in viro. Е разделе III (9 глав) изложены результаты исследований фосфатного метаболизма мозга методом ЯМР Р in vivo под влиянием патологических воздейетвк.1. Каждый раздел содержит краткий литературный обзор по изучаемой проблеме, описание материалов, использованных в работе, методик исследования и способов их разработки, обсуждение полученных результатов. В заключении подведены итоги работы и представлены выводы. Общий объем диссертации 270 страниц. Экспериментальный материал представлен на 48 рисунках и 19 таблицах. Список цитируемой литературы включает 283 наименования.