Введение к работе
Актуальность темы
Настояная работа посвящена рассмотрению закономерностей безнзлучателыгого переноса энергии от ферментативно генерируемых электронно-возбужденли продуктов ка флуоресцирующие акцепторы. Инторес к этой проблеме вызван рядом важных результатов, полученных в последнее время. В частности, было обнаружено, что некоторые окислительные ферментативные реакции приводят к образовании долгоживущих (триплетних) электронно-возбужденных молекул-продуктоз. Эти молекулы способны передавать энергию на биологически важные молекулы (РНК, ДНК, рибофлавин и др.) с фотохимически-подобным преобразованием последних. Данные результаты указывают на принципиальную возможность фотохимически-подобных реакций в отсутствие внешнего источника света. Привлекательность такой гипотезы очевидна. Современная биохимия (за исключением биохимических эспектов фотосинтеза) рассматривает молекулы в основных электронных состопшіях. Согласно этим представлениям, максимальная энергия, используемая в одном акте биохимической реакции, есть энергия гидролиза мокроэргических связей. Она, как правило, находится в пределах 304 50 кДж/ моль, что соответствует 0.3+0.5 эВ на молекулу. Это значительно ниже энергии электронного возбуждения. Если реакция требует больших затрат энергии, то она, согласно этим представлениям, протекает в несколько этапов, получая энергию порциями. Очевидно, что использование энергии электронного возбуждения сделало бы возможным протекание таких реакций в одну стадию, аналогично истинным фотохимическим реакциям.
Эффективность темновых фотохимически-подобных реакций должна, видамо, определяться: зо-первых, эффективностью образования электронно-возбужденных молекул-доноров энергии и, во-вторых, эффективностью переноса энергии электронного возбуждения на акцептор, который либо сам претерпевает фотохимически-подобные изменения, либо сенсибилизирует тпкио изменения в других молекулах.
Цель работы и постановка задач
Целью настоящей работы являлось изучение закономорнос-
l-159/yr
', тей образования электронно-возбуздешшх молекул, возникающих в ходе катализируемого пероксидазой аэробного разложения кн-долил-3-уксусьой кислота (ИУК), а также изучение эффективности переноса энергии от этих молекул на акцепторы энергии. Используемый метод изучения - хемилюминесцєішшй. В качестве акцепторов электронной энергии были выбраш фотохимически-стабильные флуоресцирующие красители.
Были поставлены следующие задачи:
1) Разработать и создать экспериментальную установку дпл
изучения спектрально-кинетических закономерностей сверхзла-
бОЙ ХЄМИЛКМИИЄСЦ9ІЩИИ (ЮГ).
-
Изучить спектральные и кинетические характеристики ХЇ в ходе катализируемого пероксидазой аэробного окисления ИУК.
-
Изучить влияние флуоресцирующих красителей на химические и хемилюминесцентше параметры реакции ферментативного окисления ИУК.
-
Определить эффективность переноса энергии с ферментативно генерируемых элэктронно-вогбужденных молекул на флуоресцирующие красители. ,,
Научная новизна результатов
Создана высокочувствительная автоматизированная установка, позволяющая изучать спектрально-кинетические характе- ристики сверхслабой ХЛ (с чувствительностью «100 квантов в сек.). Обнаружено, что при катализируемом пероксидазой окислении ИУК образуется, по крайней море, три типа электронно-всзбужденных продуктов, излучакщих при разных длинах волн. Определены вотви ферментативной реакции, в которых они формируются. Изучено влияние акцепторов энергии на ход феркун-тотивной реакции. Разработан новый подход к изучении, переноса энергии с ферментативно генерируемых электронно-возбужденных продуктов на эти молекулы-акцепторы. Обнаружен эффективный перенос энергии на некоторые красители из ряда ксантенових и фенантролішовнх; показано отсутствие переноса на исследованные оксазолинэвые и акридиновые красители. Опре делены константы Штерна-Фольмера для переноса энергии. Для объяснения эффективного переноса энергии предложена модель ассоциации фермента с красителем - акцепторы энергии. Обнаружено ранее неизвестное явление возрастания скорости фер-
мвнтативной реакции при переносе энергии от возбужденных продуктов, образуемых в ходе ее. Предложены гипотетические модели, объясняющие это явление.
Практическая ценность
Созданный хемилюмгоюмэтр может быть использован при исследовании широкого круга задач. В частности, для определения активности иммунных систем растений и животных. Хекзілю-минесцентный способ может быть применен для определения концентрации ИУК.
Результаты экспериментов по спектральному и кинетическому изучению ХЛ, возникающей при окислении ИУК, могут быть использованы при решении ряда задач биоэнергетики. Результаты экспериментов по переносу энергии на флуоресцирущие красители говорят о возможности существования "фотохимии в темноте" и стимулируют исследования в данной области.
Апробация работы и публикации
Результаты диссертационной работы доложены на 18 ежегодной конференции молодых ученых и специалистов КазГУ им. С.М.Кирова (Алма-Ата, 18-22 марта 1989 г.), на 20 конференции молодых ученых биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 24-29 апреля 1989 г.), на научных семинарах кафедры атомной физики и кафедры биофизики физического факультета МГУ. По материалам диссертации опубликовано 4 ра-* боты.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, семи глав, выводов и списка литературы. Диссертация содержит 44 рисунка и 11 таблиц в тексте. Цитируется 128 литературных источников.