Введение к работе
Актуальность темы.
Флуоресцентная диагностика (<Ш злокачественных
новообразований имеет большое значение в клинической практике. В основе метода леяит способность некоторых красителей преимущественно накапливаться в опухолевых тканях. При сблучешш опухоли светом определенного спектрального состава, близкого к максимуму полосы поглощения красителя, можно получать контрастную картину распределения красителя в ткани, что позволяет 'эффективно диагносцировать локализацию опухоли. Достоверное обнаружение местоположения опухоли необходимо и в том случае, когда в качестве лечения применяется фотодинамическая терапия (ФДТ). ФДТ , основана на том, что некоторые красители - фотосенсибилизаторн (ФС) накапливаются в опухоли и при облучении светом в полосе поглощения переходят в возбужденное состояние. В этом состоянии молекулы красителя участвуют в фотохимических реакциях, которые, в конечном счете, приводят к гибели клеток. Однако, красители, применяемые при ФДТ, накапливавтя не только в опухолях, но и в нормальных тканях. Исходя из этого, особое значение имеет точное определение локализации опухоли, что как раз позволяет ФД.
.Как для ФД, так и для ФДТ в качестве красителя может быть использованы производные гематолорфиринэ (ПГП) или их фракции. Однако, ПГП имеет ряд недостатков: нестабильность как на свету, так и в темноте, длительное невнведение из тканей, слабое поглощение в красной области оптического спектра, для которой характерно более глубокое проникновение света в ткани, недостаточная селектишгать накопления в опухоли по сравнению с нормой.
В связи с этим активно ведется поиск новых, более эффективных для целей ФД красителей. Клинические исследования последних лет показали, что краситель флуоресцеин натрия (Фл) с высокой селективностью накапливается в ряде злокачественных образованна человека. Этот краситель . обладает высокой стабильностью, не токсичен для организма и имеет практически стопроцентный квантовый выход флуоресценции. Это позволяет эффективно использовать Фл для ФД. При этом достоверность диагностики высока - не хуже 85. Кроме того, использование Фл дает хорошую возможность для диагностики рака на самых ранних, начальных этапах развития патологии, вплоть до предрака.
- Одной из актуальных проблем в изучении возможности ФД является исследование механизмов накопления и локализации Фл в клетках. Вааными параметрами, влияющими на накопление красителя в клетках, является концентрации "ионов водорода во внутриклеточной и внешней среде. От величины внутриклеточного рН. зависит распределение молекул красителя по ионным формам внутри' клетки. Ввиду этого, представляется актуальной задача исследования роли рН в процессе накопления Фл клетками. Кроме того, на процесс накопления Фл в клетках влияет температура, ионный состав внешней среда, концентрация красителя во внешней среде.
Основной целью работы являлось исследование особенностей механизма накопления Фл клетками в культуре.
При этом решались следующие задачи:
-
Иследовать- зависимость кинетики накопления Фл в клетках от величины рН внутриклеточной и внешней среды.
-
Проанализировать изменение кинетик накопления и выведения Фл из клеток при сменене ионного состава и величины рН внешнего
Зуфера.
3. Изучить влияние температуры на накопление Фл в клетках.
4. Исследовать возможность связывания -Фл внутри клеток и
зависимоть этого процесса от величины внутриклеточного рН и
концентрации Фл в клетке.
На загтлту выносятся следукие положения:
1. Разработана/методика,- позволяющая производить измерение
величины внутриклеточного рН с-точностью не хуже 0,03 единиц рН з
отдельно взятой клетке одновременно с исследованием накопления
красителя внутри клеток'с возможной вариацией внешних параметров:
рН и ионного состава внешней среды, температуры и концентрации
красителя.
2. Обнаружено, что накопление красителя в клетках
существенны?,! образом зависит от величины градиента рН мезду
клеткой и внешей средой. Получены кинетики накопления для
различных значений рНе внешнего буфера на различных клеточных
культурах.
3. На основе анализа экспериментальных данных сделан вывод о .
том, что краситель Фл мокет связываться с белковыми молекулами
внутри клетки, причем доля связанного красителя достаточно велика
и зависит от величины внутриклеточного рН . Получены зависімости
связывания Фл внутри клетки от его концентрации, причем при
больших концентрациях красителя наблюдается эффект "насыщения
связывания". Сделаны оценки концентрации возможных "мест
связывания" в клетке з 10-. величины константы диссоциации Кд2=
5*10- и энергии'связи красителя в комплексе с белком s 10кТ.
4. Проанализированы зависимости накопления Фл от ионного
состава внешнего буфера и температуры. На основе полученных
кинетик сил сделан вывод о несущественной роли активного транспорта и опре делящей роли пассивной диффузии нейтральной форщ Фл в процессе проникновения молекул красителя внутрь клетки.
5. Настроена математическая модель, описывающая влияние
величины рН внутри и вне клетки на процесс внутриклеточного
накопления Фл. учитывающая проникновение красителя в клетку за
счет пассивной диффузии его нейтральных молекул и возможное
связывание красителя внутри клетки.
6. Обнаружено явление медленного выведения красителя из
клетки nps смене величины рН внешнего буфера.
Научная новизна.
Построена математическая модель накопления Фл клетками с учетом связывания красителя в клетках. Предложенные системы уравнений учитывают распределение молекул Фл по ионным формам внутри и вне клетки и характеризуют влияние внутриклеточного и внешнего рй на процесс накопления Фл,.
Сделана оценки процентного содержания связанного красителя в клетке. Обнаружены зависимость накопления от концентрации красителя во внешнем буфере и эффект "насыщения связывания". Сделаны оценки концентрации возможных "мест связывания" красителя в клетке, величины константы диссоциации и энергии связи красителя в комплексе с белком. Обнаружено явление аномально медленного выведения красителя из клеток при изменении рН внешнего буфера.
Научная и практическая ценность.
Экспериментально показано, что повысить эффективность ФД можно путей дополнительного закислення внеклеточной среды .и путем
виОора оптимальной концентрации красителя.
Предложен флуориметрический метод, которій! позволяет определить величину рН среды, в которой находится краситель, в том числе и в клетке,.без использования дополнительных зондов и контролировать ее в процессе изменения внепних параметров.
Полученные результаты представляют интерес и с точки зрения выбора оптимальных условий для эффективного проведения ФД раковых опухолей в клинике.
Основные результаты диссертации долскены на 111 и IV Республиканских школах-семинарах по лазерной биологии и медицине ( Тарту, 1991 и 1992 гг.) и опубликованы в 4-х печатных работах.