Введение к работе
Аюуальностъ темы диссертации
Изучение механизмов регуляции клеточного объема является одной из основных проблем физиологии и биофизики. Неконтролируемое набухание животной клетки - которая в отличие от раститепьнон лишена жесткой клеточной стенки - приводит к разрушению плазматической мембраны, а сравнительно небольшие изменения объема в значительной степени нарушают сложный гомеостаз внутриклето<,чых химических реакций. При нарушении осмотического равновесия вследствие накопления низкомолекулярных метаболитов в цитоплазме или в ан-изогоническнх условиях в мембранах клеток различных тканей активируются исполнительные системы транспорта, которые создают регуляторные потоки осмотически активных веществ в клетку или из нее, возвращая клеточный объем к исходной величине. <" ;новной вклад в этот процесс вносят потоки калия, натрия и хлора. За последние полтора десятилетия ионные механизмы, участвующие в регуляции объема клеток, в большинстве тканей в значительной степени расшифрованы (для обзора см. Hoffmann tc Simonsen, 19К9; Sarkadi & Parker, 1991; Lang et a!., 1993). Наименее изученной в этом отнс тении оказалась центральная нервная система (ЦНС). Вместе с тем уже в экспериментальны: работах рубежа 60-70 гг. было показано, что в патофизиологических условиях происходят некомпен-сируемые изменения объема клеток и экстраклеточного пространства мозга. Это явление лежит в основе цитотоксических отеков мозга, которые развиваются после ишеыаческкх инсультов, при черепно-мозговых травмах, нарушениях функции печени, как осложнение после нейрохирургических вмешательств и являются одной из основных причин смертности в странах с развитой медициной (дл. обзора см. Ballanyi & Grafe, 1988; Kimelberg & Goderie, 1988. Зивин и Чой, 1991; Arieff, 1993; Lobalo, 1993).
Связь работы с крупными научными программами
Различные этапы этой работы выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований (регистрационный № 01.89036810), программы "Университеты России" (грант М-221), грантов 93-04-7518 Российского Фонда Фундаментальных Исследований и Б8-305 Фонда Фундаментальных Исследований Республики Беларусь
Цель работы
В рамках данного исследования предполагалось идентифицировать ионные и внутриклеточные механизмы, вовлеченные в процесс регуляторного уменьшения объема в глиальных н нейрональных клетках центральной нервной системы.
Задачи исследования
изучение транспортных систем, формирующих входящие и выходящие потоки К+, в четырех клеточных моделях ЦНС (изолнрованнных нервных окончаниях мозга крысы и культурах клеток нейробласгомы NIXTG2, глиомы С6 и первичных астроцитов мозга крысы);
выяснение характера влияния гипотонического набухания на тестируемые системи транспорта К+;
определение направления нетто-потоков К+ при набуха'пи изучаемых типов клегок и анализ возможного вклада этих потоков в ;гуляцию клеточного объема;
оценка роли кальция и кальмодулина в гипотонической активации ионного транспорта в клетках центральной нервной системы,
изучение возможного участия различных типов фосфорнлнррчания мембранных белков в трансдукции осмотического сигнала в клетках ЦНС;
выявление сходства и различая в ионных механизмах регуляции объема и путях трансдукции осмотического сигнала в клетках шкального и нейронального происхождения.
Научная новизна полученных результатов
Установлено, что гипотоническое набухание всех изученных клеточных моделей сопровождается формированием направленного нз клетки нетто-потока К+, опосредованного активацией двух типов катионных каналов: кальций-чувствительных калиевых и, предположительно, механочувствителы ых неселективных катионных, но не электронейтрального симпорта калия и хлора.
Впервые показано, что набухание клеток ЦНС вызывает активацию не только оттока, но и накопления калия. Этот процесс связан со стиы,ляцией натриевого насоса и направленного внутрь клетки Ыа+,К+,2С1"-котранспорта. Предполагается, что физиологическая роль активации этих транспортных систем состоит в востановлении высокого трансмембранного градиента К+, который диссипирует в процессе регуляторного уменьшения клеточного объема.
В синаптосомах мозга крысы и клетках глиомы Сб продемонстрировано существование-активируемых набуханием кальциевых каналов. В синаптосомах выявлены кинетические и фармакологические отличия этих каналов от потенциал-чувствительных кальциевых.
Доказана роль кальмодулина и кальций/кальмодулин-зависимого фосфо-рилирования белков в объемной активации калиевых каналов и Na+,K+,2C1"-котранспорта.
Практическая значимость работы
Результаты работы существенно расширяют и углубляют современные
предсталления об огмотической регуляции ионного трансгорта в клетках центральной нервной системы. Полученные данные позволяют разрабатывать новую стратегию поиска лекарственных средств для лечения цигозоксических отеков головного мозга.
Основные положения диссертации, выпооимые ма защиту
-
Набухание клеток цьнтралькой нервной системы сопровождается акти-в:щиеії выходящи:; (опосредованных стимуляцией кальцчй-чувствмтельных калиевых ч песелективнь:* катионных каналов) и входящих (формируемых натриевым насосом и направленным внутрь Ка+,К.+,2СІ'-когранспорто\і) потоков К"1. Нетто-поток катиона направлен из клетки и определяет регульториос уменьшение объема.
-
Гипотоническое набухание сопровождается активацией объем-чувстпц-тельных кальциевых каналов, которые в ссналтосомах мозга крысы Iі ктегках глиомы С5 по своим кинетическим и фгрмякологическим свойствам оглчча'отся от петенциал-чувстзнгельных кальциевых.
-
В осмотическую регуляцию к<лиевых каналов, натриевого насоса и Na+,K+.2Cl"-KOTpaHcnopTa вовлечен кальмоаутин. Функциональная активность калиевых каналов н электронейтрального симпорта Na+, К.+ и С1" находится под контролем ферментатизпой пары протеникиназа. С / протеинфосфатаза. Гипотоническая стимуляция этих систем опосредована акгигацией процессов кальний/ кальмодулин-завненмого фосфорилиров<інлл белков.
Апробация результатов диссертации
Результаты исследований апробированы на заседании Московского общества испытателей природы ( г. Москва, 27 марта 1993 г.), I Европейской конференции "Функции глиальных клеток в норме и при патологии" (Heidelberg, March 24-27, 1994), Конференции Жака Монр "Фосфорилирование белков: от струкгуры к функции" (Aussois, September 19-22, 1994), XV Конгрессе IL'BME (New Delhi, September J 8-22, і994;, ] Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (г. Минск, 22-23 ноября 1994 г.). I Международной школе молодых российских кейрохіїмиков "Новые достижения в изучении метаболизма мозга" (С.-Петербург, 1-3 февраля 1995 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ. .
Объем и структура диссертации