Введение к работе
Активные формы кислорода, такие как гидроксил и супероксид радикалы, перекись водорода и синглетный кислород образуются в процессе аэробного метаболизма в клетке и под воздействием у-радиации, ультрафиолетового излучения, различных токсинов, красителей, ряда лекарств ( Ames, 1983), вызывая нарушения в структуре нуклеиновых кислот, белков, липидов.
Одним из наиболее существенных биологически значимых генотокси-ческих повреждений в ЛИК под действием некоторых активных форм кислорода является 8-оксидезоксигуанозин. Этот тип повреждения играет важную биологическую роль в мутагенезе, канцерогенезе и старении (Breimer, 1990).
Содержание 8-оксигуанозина в крови или выделяемого организмом с мочой служит маркером физиологического неблагополучия организма
Основная часть научных работ ведется по исследованию возникновения этого повреждения в ДНК. Образование 8-oxo-G в РНК и следствия модифицирования по восьмому атому GTP, играющим важную роль во многих внутриклеточных реакциях, сравнительно мало изучено. Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы было изучение воздействия г-излучения на гуаниловые нуклеозиды и нуклеотиды, мочевую кислоту и выяснение
влияния 8-замещенных аналогов GTP на синтез опигонуклеотидов в РНК -полимеразной реакции , а также выяснение возможности синтеза polyOxoG полинукпеотидфосфорилазой.
Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем:
1) Исследование субстратных свойств 8-oxo-GTP u 8-Br-GTP в
реакции синтеза опигонуклеотидов РНК-полимеразой E.coli
на промоторе А1 ДНК фага Т7 ДД 111 при ограниченном наборе
субстратов и изучение кинетики ингибирования.
-
Исследование методом дифференциальной УФ спектроскопии образования 8-оксипроизводных гуаниловых нуклеозидов и нукпеотидов под действием ионизирующего излучения.
-
Исследование методом УФ-спектроскопии воздействия у-радиации на мочевую кислоту.
4) Синтез полинуклеотидов полинуклеотидфосфорилазой с
включением 8-oxoG с перспективой использования подобной матрицы в
системе синтеза белка.
Научная новизна работы
В результате настоящей работы исследовано образование 8-оксигуа ниловых производных при j-облучении растворов нуклеозидов и нуклео тидов ( Guo, dGuo, GMP, dGMP, GDP u GTP). При облучении нуклеозидов в HgO и в D-0 обнаружено, что механизмы формирования 8-окси-гуанина под действием у-облучения и тепла отличаются друг от друга. При 37 уровень повреждений клеточного нуклеотидного фонда dGTP, индуцированных природным радиационным фоном, составляет приблизи*-тельно О, 2% от теплового, а при температуре 4 С « 20 '/.. Аналогичные оценки, сделанные для ДНК, показывают, что радиационное воздействие на нуклеотидный клеточный фонд dGTP больше чем на ДНК. При воздействии у-радиации на мочевую кислоту и гуанозин наблюдается медленное пострадиационное разрушение хромофорных групп. Мочевая кислота « в 3 раза менее устойчива к действию радиации по сравнению с гуанозином.
Обнаружено, что 8-BrGTP является ингибитором, a 8-oxoGTP проявляет неоднозначные субстратно-кодовые свойства в системе синтеза опигонуклеотидов РНК-попимеразой Bscherihia colx на промоторе А1 ДНК фага Т7 ADlll при ограниченном наборе субстратов. Рассчитаны количественные характеристики связывания этих аналогов нукпеотидов в центрах фермента, геометрия которых приспособлена для включения АТР и UTP. 8-oxo-GTP u 8-Br-GTP конкурируют с АТР (отношение равновесных констант диссоциации 2,1 и 2,4 при значении константы для АТР 0,3 мм), но в отличие от АТР не включаются в
состав продукта. 8-oxo-GTP конкурирует также и с UTP ( Отношение равновесных коне інт диссоциации 21,8 при значении константы для UTP 0,03 мМ). 8-Br-GTP с центром связывания UTP не взаимодействует. 8-oxo-GTP в отличие от 8-Br-GTP u GTP способен замещать UTP при синтезе тетра- и пентануклеотида. Замена GTP на 8-oxo-GTP и 8-Br-GTP при синтезе на слабом D-промоторе не приводит к инициации синтеза , что говорит о неспособности данных аналогов быть инициа-торными нуклеотидами.
В системе синтеза с полинуклеотидфосфорилазой синтезирован полинуклеотид polyAoxoG с соотношением нуклеотидов A:oxoG 2:1 и 3:1 и длиной цепи 30-100 звеньев и полинуклеотид polyoxoG с длиной цепи 30-70 нуклеотидов.
Научно-практическая ценность работы.
Апробирован методический подход оценки радиационного и теплового повреждения нуклеотидов методом дифференциальной УФ спектроскопии.
Биологическая роль, обусловленная проявлением неоднозначных субстратно-кодовых свойств 8-oxo-G , является существенной для понимания некоторых путей спонтанного, радиационного и химического мутагенеза и канцерогенеза.
Использование модельных систем позволяет приблизиться к пониманию узнавания РНК-полимеразой нуклеотидов. Сравнение 8-BrGTP и 8-oxo-GTP дало возможность проверить гипотезу об образовании РНК-полимеразой водородных связей с атомами С8 и N3 пуринов и Сб и 02 пнримидинов в парах A=U u Gsc, Встраивание 8-oxoG вместо и говорит о возможности образования водородных связей узнающим центром РНК-полимеразы с 8-0 атомом 8- oxoGTP (в син-конформации), расположенном на месте 02 атома UTP, что может свидетельствовать в пользу этой гипотезы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, их обсуждения и выводов. Материал изложен на