Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что живые клетки ведут сесія как осмометры: в гипертонической среде, теряя воду, уменьшаются в размерах, а в гипотонической среде, наоборот, поглощая воду, набухают. Во всех исследованиях, которые проводились до сих пор в области изучения активных и пассивных свойств мембраны, изменениям объема и поверхности клетки уделялось мало внимания. По этой причине в литературе существовало представление, согласно которому число функционирующих белковых молекул мембраны представляет собой относительно постоянную величину и может изменяться только путем изменения скорости их синтеза, в результате которого в мембране появляются новые молекулы взамен погибших старых. С помощью такого динамического процесса белковые молекулы мембраны, имеющие ферментативные, транспортные, канальные, рецепторные и другие функции, непрерывно обновляются. При этом возможность изменения числа функпионируюших.;молекул в_.зависимости от изменения объема и величины поверхности клетки никогда не рассматривалась. Такое допущение затрудняло, а в некоторых случаях и делало невозможным, объяснение некоторых противоречивых экспериментальных данных, полученных разными авторами. Одним из таких спорных вопросов является, например, зависимость активности работы электрогенного натриевого насоса от изменения объема и поверхности клетки в растворах с различной тоничяостьго. В одних работах было показано, что при уменьшении объема клетки активность работы натриевого насоса увеличивается, в других - уменьшается, а в третьих не было обнаружено никакой связи между ними.
Другой вопрос, который также не нашел свое достойное мєсїїо в цепи исследований физико-химических свойств клетки является поток воды через клеточную мембрану. Нарушение осмотического равновесия клетки всегда приводит к возникновению потока воды через клеточную мембрану, который уравновешивает осмотические давления растворов внутри и снаружи клетки,"в результате которого происходит ее сморщивание или набухание. Таким образом при исследовании физико-химических свойств мембраны следует учитывать возможный вклад потока воды в изучаемый феномен. Исследованиями Тасаки и Иваса ( Tase&i & iwasa, 1982 ) было показано, что в период генерации потенциалов действия аксон набухает во время восходящей и сморщивается во время нисходящей фазы потенциала действия. Это свидетельствует о том, что во время потенциала действия происходит поток воды через мембрану. Естественно предполагать, что этот
поток вода будет сказываться на свойствах потекдаалозавнсимых ионных каналов мембраны. Однако до свх пор нет воеооъекясввх вссладо-ваянЗ дейотвия потока воды на основные алектровозбудвше каналы,
ВОТОрНе ПОЗВОЛИЛИ бы ВЫЯВИТЬ ОЛеПИфИЧНОСТЬ ЭТОГО явленая дня каждого типа канала.
Даль работы. Целью работы явилось исследование роли изменения объема я величины поверхности клетка в регуляции фнзнко-хишчес-Н5х свойств мембраны, а также вляяиея трансмембранного потока воды на нонкке тол мембрани.
Основные задача исследования;
-
Исследование загасимости активности работы натриевого на-оооа от нзмеяения объема н поверхности клетки. '
-
Выявление изианеякя числа функцкошгрупдах белковых молекул мембраны, имчіщіі ферментативній, транспортные в канальные свойства, во арами изменения объема в поверхности клетки.
-
Изучение взманенЕЯ внутриклеточной концентрации ионов натрия в зависимости от взмененкя объема клетки.
-
Исодадование влияния стационарного потока воды через мембрану на ионные токи.
-
Изучение природы отрицательного сопротивления мембраны вдвнтифнцнрованного нейрона ШаІ ЦНС виноградной улитки Веіїх ро-matia в его зависимость от изменения объема в поверхности клетки.
-
Выяснение роли изменения текучести мембраны в изменении объема в поверхности клетки в модуляции активности работы натриевого насооа в электрических свойств мембраны.
Научная новизна в практическая ценнооть» Диссертация пред— отавляет ообой первое комплексное, сввтематвческое иооледование по выяснена» роса изменения объема клетки в регуляции фвзвко-хишческхх свойств НвМбрЕНЫ.
Разраббтан метод вепрернвной регистрации изменения объема изолированного нейрона в различных фуввщональннх состояниях, позвол-яхияя іфоолйднть за динамикой ввмввеввя объема клетки при измене-янв внеянхх условий. Впервые показано, что объем клетки изменяется ве непрерывно, а ступенчато, скачками.
До настоящего времени в литературе существовало предотавлшне, согласно которому число фуншдсниружяих белковых молекул мпмбрппн цреиДОвляет собой относительно постоянную величину в мохе* тимо вятъсв тохыю путем шимінпгіг скорости вх овнтеза. В результате тефбгжчвЬхкх анализов в зкишрюаятвльннх иосладоввиий впервые — золавахо, что число (Ьяквсопддиякх балипшт молакух миибриіііі.
(о
имепфос ферментативные, транспортные и канальные свойства, может изменяться просто путем механического открывания окладов мембраны в результате изменения объема в площади поверхности клетки, де-экранировання белковых молекул в вх ввода в дейотвве. При атом скорость оинтеза я общее число белковых молекул (функционирующих и нефушаяонирупцах) может не изменяться. Это свидетельствует о том, что э мембране белковые молекулы находятся в двух различных состояниях - функционирующем и резервном в нх соотношение при нормальной жизнедеятельности клетка вое время изменяется в зависимости от вивших условий в функционального состояния клетки. Таким образом опровергнуто прежнее представление о том» что число функционирующих белковых молекул мембрани всегда постоянно в ако-перкментадьно доказано, его изменение в результате изменения объема и шгощада поверхности клетки. Это вносят принципиальяне изменения в првдотавленяо о функционировании белковых молекул мембраны, и клеток в целом и позволяет по новому интерпретировать полученные экспериментальные данные.
Впервые теоретически обосновано в экоиерамонтально доказано, что эффект изменения объема клетки на аятизаость олектрогвнного натриевого насоса зависит от уровня внутриклеточной концентрации натрия. При низких уровнях внутриклеточной концентрации натрия, когда еще не происходило насыщение алвктрогеаного транспорта натрия ионами натрия, уменьшение объема клетки в гипертонических растворах приводит к активации работы натриевого насоса, а при высоких уровнях, когда происходит насыщение транспортного механизма натрия яонаиі натрия, уменьшение объвт плетка приводят в инактивации натриевого насоса из-еа уменьшения числа функцнокяру-вдих На,к-АИ>азннх молекул (насосных единиц) шмбракы.
С помощью внутриклеточной перфузии диализврованного нейрона показана тесная взаимосвязь между потоком воды черев мембрану в мембранными ионными токами. Поток воды через мембрану увеличивает трансмембранлне ионные токи, если градиент осмотического давления я ионные градиенты совпадают по направленно, и уменьвает их, если градиенты ионов и осмотического давления направлены дротявопот ложно.
Впервые показано, что повышение осмотического давления среды уменьшает, а понижение - увеличивает, отрицательное сопротивление мембраны идантифишроваяяого нейрона пачечного «она Ша! виноградной улитки.
Впервые обнаружена тесная взаимосвязь между текучестью мен- -
браны к объемом клетки. Увеличение текучести мембраны под действием делиденовой кислоты приводит к набуханию, а уменьшение текучести под действием кетамина - к сморщиванию клетки.
Подученные в диссертации данные позволяют величину клетки рассматривать как важный параметр, определяющий ее функциональное состояние.
Практическая ценность работы заключается в том, что она открывав? новые возможности для целенаправленной регуляции ферментативной, электровозбудимой и хеморецептивяаи функций мембран путем регуляции эффективной поверхности клеточной мембраны. Сйа позволяет путем увеличения площади поверхности клеточной мембраны (например понижением осмотического давления окружающей клетку среды) повысить ее чувствительность к фармакологическим препаратам, что очень важно при скрининге особенно дефицитных и дорогостоящих препаратов и биологических соединений.
Апробация работы. Материалы диссертации неоднократно представлялись и обсуждались на международных и Всесоюзных симпозиумах: на I Всесоюзном симпозиуме "Мембранная энзимология и проницаемость мембран" (Ереван, 1977), на конференции молодых ученых, посвященной 60-летию Великой октяброкой революции (Ереван, 1977), Всесоюзном симпозиуме "Транспортные АТФазы" (Тбилиси, 1978), ХХУІІ Международном конгрессе.по,физиологическим наукам (Будапешт, 1980), первом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), 5-й Всесоюзном съезде фармакологов (Ереван, 1982), II республиканской конференции, посвященной физико-химической биологии (Ереван, 1986), Всесоюзной конференции по неиронаукам, посвященной 100-чте-тию со дня рождения академика АН УССР Д.С .Воронцова (Киев, 1986), II Всесоюзном симпозиуме "Мембранная энзимология и проницаемость мембран (Ереван, 1986), III симпозиуме СССР-ФРГ "Возбудимые мембраны" (Киев, 1987), заседании нейрофизиологов института психиатрии им. Макс-Планка (Мюнхен, 1988), заседании нейрофизиологов Дюссельдорфского университета (Дюссельдорф, 1988), Международном симпозиуме Транспорт ионов и механизмы его регуляции (Тбилиси, 1989).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав результатов и обсуждений, выводов и описка литературы.
Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста и включает 89 рисунков и 2 таблицы. Список литературы содержит 369 источников (22 отечественных г 247 иностранных).