Нативный фитохром овса: особенности конформационного состояния красной и дальней красной форм in vitro Кожух, Геннадий Викторович

Введение к работе

Актуальность темы диссертации. Семейство фитохромов (фитохромы А, В, С, D, Е) является наиболее изученным из известных растительных фоторецепторов. В этиолированных растениях в пуле фитохромов большая часть приходится на фитохром А. До настоящего времени остаются неизвестными ^механизмы реализации фитохром-зависимых эффектов в растении. Известно, что их стартовым событием является конформационпое превращение при трансформации красной в дальнюю красную форму. Поэтому актуальной задачей является выявление конформационных различий между физиологически активной Ф_дк- и неактивной Ф_к-формами фитохрома А физико-химическими методами.

Актуальность подобного исследования обусловлена также необходимостью пересмотра полученных ранее результатов на частично деградированном фитохроме (60 кДа и 114/118 кДа), так как оказалось, что физико-химические свойства нативного (М.М.= 124 кДа) и деградированных видов хромопротеина существенно отличаются.

В рамках решения данной задачи актуальной является разработка эффективной методики выделения нативного фитохрома А, поскольку по известным методикам выделение хромопротеина занимает продолжительное время и имеет невысокий выход очищенного препарата.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Отдельные этапы научных исследований, результаты которых обобщены в представленной работе, выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований по темам:

"Исследование зависимости регуляторних свойств фитохромной системы от ее физико-химической организации" (1987 - 1989 г.г.), N госрегистрации 01870037714;

"Изучение взаимосвязи молекулярной организации и функционирования фитохромной системы в растительной клетке" (1990 - 1994 г.г.), N госрегистрации 01900027723.

- "Исследование промежуточных стадий процессов трансдукции световых сиг
налов в клетке" (1996-2000 г.г.), N госрегистрации 1996294;

- "Поиск и идентификация белков растительной клетки, участвующих в
трансдукции световых сигналов" (1996-1998 г.г.), N госрегистрации 19962442.

Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы явилось исследование конформационного состояния красной и .дальней красной формы нативного (124 кДа) фитохрома А овса. Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод быстрого спектрофотометрического определения содержания фитохрома in vivo и с его помощью оценить возрастные и сортовые различия в содержании фитохрома в этиолированных проростках овса.

1. Усовершенствовать методику выделения нативного (124 кДа) фитохрома овса с целью увеличения выхода чистого белка и сокращения времени выделения.

2. Охарактеризовать полученный препарат фитохрома, провести сравнительный анализ ряда его физико-химических свойств с соответствующими данными, приведенными в литературе.

3. Провести зондирование Ф_к- и Ф_дк-форм нативного фитохрома с помощью нафтил-сульфонатных зондов (АНС, ТНС), позволяющее идентифицировать при фотоконверсии появление на поверхности макромолекулы хромопро-теина гидрофобных сайтов.

4. Изучить конформационные особенности красной и дальней красной форм нативного фитохрома овса по их чувствительности к денатурирующему действию высоких температур и детергентов различной химической природы.

5. Определить конформационные различия Ф_к- и Фдк-форм фитохрома по их чувствительности к ограниченному протеолизу.

7. Определить количество поверхностно-локализованных сульфгад-
рильных групп и дисульфидных мостиков в макромолекулах Ф_к- и Ф_дк-форм
фитохрома.

Объект и предмет исследования. Объектом настоящего исследования был растительный фоторегуляторный хромопротеин - фитохром А. Предмет исследования - конформационные состояния биологически неактивной красной (Ф_к) и активной дальней красной формы (Ф_да) фитохрома.

Методология и методы проведенного исследования. При выполнении работы были использованы многие современные методы исследования белков -спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, зондирование с помощью флуоресцентных зондов, ограниченный протеолиз, ДСН-электрофорез. При выделении и очистке фитохрома использовали гель-проникающую и аффинную адсорбционную хроматографию, метод избирательного растворения.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Разработана новая методика выделения нативного фитохрома А овса, что позволило существенно снизить время выделения и увеличить выход высокоочищенного препарата нативного фитохрома.

На основании установленной корреляции между оптической плотностью образцов и содержанием фитохрома в растительной ткани выявлены сортовые и возрастные различия в содержании фитохрома в этиолированных проростках овса.

Впервые проведен прямой сравнительный анализ флуоресцентных свойств фитохрома овса in vitro и in vivo. Показано сходство флуоресцентных параметров хромопротеина в двух состояниях.

Изучена термостабильность различных форм фитохрома. Обнаружена более высокая термостабильность дальней красной формы фитохрома in vitro.

Исследовано влияние детергентов различной химической природы на спектральные параметры Ф_к- и Ф_дк-форм фитохрома. Показано, что меньшую чувствительность по отношению к детергентам проявляет Ф_дк -форма.

Проведено зондирование структуры Ф_к- и Ф_дк- форм нативного фитохрома с помощью нафтилсульфонатных флуоресцентных зондов (АНС, ТНС) и выявлены различия в их взаимодействии с нативным (124 кДа) и частично деградированным (114/118 кДа) фитохромами. Показана важная роль N-концевого фрагмента хромопротеина в структурно-функциональной организации молекулы.

Определено количество поверхностно локализованных SH-групп у Ф_к- и Ф_дк-форм. Показано, что дисульфидные мостики в молекуле фитохрома отсутствуют.

Установлены конформационные различия красной и дальней красной форм фитохрома, проявляющиеся в особенностях локализации пептидных связей в участках полипептидной цепи на поверхности макромолекулы, чувствительных к протеолизу.

Практическая (экономическая, социальная) значимость полученных результатов. Выявленные в диссертации особенности конформационных состояний красной и дальней красной форм фитохрома, контрастно различающихся по своей биологической активности, позволяет в перспективе разработать методы целенаправленного управления фитохромной регуляцией различных физиологических процессов в растении.

Методика выделения и очистки нативного фитохрома представляет практический интерес для специалистов, работающих в области фотобиологии и физиологии растений, поскольку позволяет получать большие количества нативного фитохрома из различных видов растений, что важно для физико-химического анализа хромопротеина.

Существование корреляции между оптической плотностью образцов при 730 нм и содержанием фитохрома в растительных проростках использовано для экспресс-анализа содержания хромопротеина в тканях растений овса различных сортов и возраста.

Некоторые результаты диссертационной работы вошли в монографии и обзорные статьи и используются в курсах лекций по фотобиологии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Установление сортовых и возрастных различий содержания фитохрома в этиолированных проростках овса.

2. Разработанная новая методика выделения и очистки нативного фитохрома овса, позволяющая получать высокоочищенный нативный фитохром с большим выходом и гораздо быстрее по сравнению с другими методиками.

3. Обнаружение различия конформационньгх состояний Ф_к- и Ф_дк-форм фитохрома по чувствительности хромопротеина к действию высоких температур и детергентов, протеолизу, а также по экспонированности сульфгидрильных групп белка.

Личный вклад соискателя. Выбор условий эксперимента, получение экспериментальных данных, анализ и интерпретация полученных результатов проведены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 6-й и 7-й конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988, 1991), на Втором Всесоюзном съезде общества физиологов растений (Минск, 1990), на Первом съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994).

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (6 статей в научных журналах и 3 тезиса докладов) на 41 странице.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 152 источника. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста и проиллюстрирована шестью таблицами и 35 рисунками.