Начальная агрегация тромбоцитов и ее изменение при химической модификации клеточных мембран Бержицкая, Валерия Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Во многих случаях сердечно-сосудистых, хирургических, онкологических заболеваний, при диабете повышенная активность тромбоцитов приводит к тромбозам [Wu К.К., 1996]. Поэтому сейчас ведётся широкий поиск средств, подавляющих активность тромбоцитов [Becker R.C., 1992]. С другой стороны, при пониженном функциональном состоянии этих клеток возникают внутренние кровотечения, геморрагический синдром, анемии. Для борьбы с этими осложнениями в клинике применяется переливание концентрата тромбоцитов [Аграненко В.А., 1994]. Во всех этих случаях необходима адекватная оценка функционального состояния этих клеток.

В качестве основного показателя активности тромбоцитов используют их способность к агрегации, вызываемой каким-либо индуктором (агонистом). Чаще всего агрегацию тромбоцитов исследуют с применением турбидиметрического метода Борна, регистрирующего образование крупных агрегатов (вторичную агрегацию тромбоцитов) [Bom G.V.R., 1962]. Однако уже в первые секунды с момента индукции происходит начальная агрегация тромбоцитов - образование мелких агрегатов, состоящих из 5-Ю клеток [Frojmovic М.М., 1983]. На этом проявление активности клеток может заканчиваться. Такая агрегация не фиксируется турбидиметрически-ми агрегометрами, что может привести к ошибочной оценке функционального состояния тромбоцитов. Изучение начальной агрегации тромбоцитов важно как для адекватной характеристики этих клеток, так и для исследования механизмов формирования агрегатов.

Недавно в нашей лаборатории был разработан новый нефелометриче-ский метод анализа агрегации тромбоцитов [Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю., 1995]. Этот способ позволяет регистрировать образование мелких агрегатов тромбоцитов, т. е. именно начальную агрегацию тромбоцитов. Можно предполагать, что использование нефелометрического способа может оказаться особенно эффективным при исследовании (1) агрегации тромбоцитов в присутствии свёртывающейся плазмы крови; (2) агрегации изолированных слабоактивных тромбоцитов, например, на поздних сроках хранения их концентрата, предназначенного для трансфузии; (3) активности тромбоцитов с использованием низких концентраций индукторов.

Регистрация начальной агрегации тромбоцитов позволяет достаточно быстро и эффективно оценивать их функциональное состояние. Поэтому представлялось возможным провести исследование, интересное с прикладной точки зрения. Известно, что для оценки степени чистоты воды иногда применяют биологические тесты [Поворов А.А., 1994]. Предполагалось выявить изменения начальной агрегации тромбоцитов под влиянием на них примесных соединений из состава водопроводной воды.

Для лечения тромбозов, опосредованных тромбоцитами, может требоваться всеобщая инактивация тромбощггарных клеток, то есть подавление их активности независимо от природы индуктора и механизма внутриклеточной передачи сигнала. Это можно ожидать при химической модификации плазматической мембраны в целом. С этой целью необходимо

исследовать, изменение каких конкретных химических групп плазматических мембран тромбоцитов может приводить к их ингибированию. Поэтому предполагалось изучить начальную агрегацию тромбоцитов при воздействии на них флуорескамина (связывающего аминогруппы), дитионит-робензойной кислоты (окисляющей сульфгидрильные группы) и ацетилсалициловой кислоты (ацетилирующей гидроксильные группы).

Также перспективно для этой цели использование продуктов миелопероксидазной реакции - гипохлорита натрия и хлораминовых производных аминокислот. До настоящего времени молекулярно-клеточный механизм их ингабирующего действия на тромбоциты детально не изучен.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей начальной агрегации тромбоцитов нефелрметрическим методом и исследование изменений агрегации тромбоцитов под воздействием соединений, химически модифицирующих клеточные мембраны. В соответствии с этим предусматривалось решение следующих задач:

1. Выяснить возможность нефелометрической регистрации начальной агрегации тромбоцитов в условиях свёртывания плазмы крови и при их пониженной активности. Изучить начальную агрегацию тромбоцитов в следующих случаях: при использовании низких концентраций индукторов; при индукции агрегации изолированных тромбоцитов аденозиндифосфа-том; при одновременной турбидиметрической регистрации изменения формы клеток; при определении агрегационной активности тромбоцитов человека, предназначенных для переливания.

2. Оценить влияние примесных соединений, входящих в состав водопроводной воды, на агрегацию тромбоцитов.

3. Исследовать ингибирование начальной агрегации тромбоцитов при химической модификации их мембран. Выяснить роль конкретных химических групп в этом процессе.

4. Исследовать закономерности ингибиррвания начальной агрегации тромбоцитов разными продуктами миелопероксидазной , реакции (гипохлоритом натрия и N-хлор-сс-аланином) при различных механизмах активации клеток.

Научная новизна исследования. Было выяснено, что начальная агрегация тромбоцитов регистрируется в условиях свёртывания плазмы крови, поскольку формирование мелких агрегатов происходит до начала свёртывания. Выявлено, что можно на одном образце изучать два процесса активации тромбоцитов - изменение формы и агрегацию. Нефелометрическим способом исследованы слабоактивные тромбоциты. При этом показано, что возможно изучение АДФ-индуцированной агрегации изолированных тромбоцитов и применение низких концентраций индукторов. Этим же способом обнаружена активность тромбоцитов на 6-7 сутки их хранения в составе концентрата. Его можно предложить для контроля за агрегационной активностью тромбоцитов, предназначенных для переливания.

Показано, что ионы кальция, содержащиеся в водопроводной воде, индуцируют переход изолированных тромбоцитов кролика в рефрактерное состояние, обнаруживаемое по критерию ослабления начальной агрегации,

вызываемой Са²⁺ в высокой концентрации. Гипохлорит натрия в концентрациях, соответствующих его содержанию в водопроводной воде, вызывает снижение Са²⁺-шщуцируемой агрегации тромбоцитов.

Установлено, что действие на тромбоциты флуорескамина (10 мкМ) и дитионитробешойной кислоты (10-S0 мкМ), взаимодействующих соответственно с амино- и сульфгидрильными группами, приводит к снижению начальной агрегации клеток. Ацетилсалициловая кислота (ІО-ІО0 мкМ), реагирующая с гидроксильными группами, не влияет на начальную агрегацию тромбоцитов. Это указывает на то, что амино- и сульфгидриль-ные группы клеточных мембран тромбоцитов важны в механизме угнетения их активности при химической модификации.

Выяснено, что противоагрегационное действие на тромбоциты гипохлорита натрия и N-хлор-а-аланина различается. Максимальное снижение агрегации наблюдается уже через 0,5-1 мин инкубации клеток с гипохлори-том, тогда как пропгвоагрегационньгй эффект N-хлор-а-аланина усиливается до 5 мин инкубации. Установлено, что подавляющее действие N-хлор-а-аланина на агрегацию тромбоцитов не зависит от природы индуктора, а интибирующее действие гипохлорита в 2-3 раза сильнее при использовании агонистов, требующих присутствия внеклеточного Са²⁺ для активации клеток. Аналогичная зависимость от механизма шадукции выявлена и при действии на тромбоциты дитионитробензойной кислоты. Полученные данные указывают на важную роль SH-групп кальциевых каналов плазматических мембран тромбоцитов в механизме действия гипохлорита натрия.

Практическое значение работы. Обнаруженные возможности нефело-метрического метода позволяют предложить этот способ в качестве адекватного контроля за агрегационой активностью тромбоцитов, в том числе предназначенных для переливания в организм человека. Полученные данные о роли амино- и сульфгидрильных групп плазматических мембран в ингабировании тромбоцитов указывают на перспективность поиска средств для борьбы с тромбозами среди химических модификаторов этих групп клеточных мембран. Обнаруженные закономерности противоагрега-ционного действия гипохлорита натрия и N-хлор-а-аланина позволяют теоретически обосновать их лечебное действие в качестве противотромбо-цитных средств и их побочное действие на тромбоциты при введении в кровяное русло в качестве детоксицирующих агентов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфу-зиологии", Санкт-Петербург, июнь 1995 г.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 33 рисунка и 3 таблицы, состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Заключение" и выводов. Список литературы включает 220 наименований.