Морфологическая гетерогенность колоний Alcaligenes eutrophus и Photobacterium leiognathi : По данным электронной микроскопии Могильная, Ольга Алексеевна

Введение к работе

Актуальность работы.

Морфология колоний микроорганизмов является важнейшим
таксономическим признаком, представляющим наследственную
морфогенетическую структуру на поверхности агара. Долгое время
считалось, что все 10⁶-10⁸ клеток, составляющих колонию, одинаковы,
однако в последние годы получены данные, свидетельствующие о наличии в
колонии нескольких субпопуляций, различающихся по морфологическим и
физиологическим признакам (Бакулина,1985; Shapiro, 1995).

Предположительно гетерогенность в колонии возникает вследствие градиента питательных веществ и продуктов метаболизма в разных ее участках (Криг, Герхардт, 1983; Шлегель,1987; Wimpenny,1989). Изучение гетерогенности микробных популяций обычно касается жидкой бактериальной культуры (Иванов, Угодчиков, 1984; Милько, Егоров, 1991), сведения о гетерогенности бактериальных колоний немногочисленны и фрагментарны (Бакулина и др.1984; Высоцкий и др., 1984; Новик, Высоцкий, 1995; Shapiro,1985,1987; Tetz,1990). В то же время интерес к данной проблеме растет, что вызвано различными задачами микробиологической практики и биотехнологии, а также имеет и чисто теоретический аспект.

Для решения вопросов гетерогенности микробных колоний в принципе применимы разные подходы, начиная от классических микробиологических, генетических и кончая управляемым культивированием и математическим моделированием популяции (Перт,1978; Печуркин и др.1990; Милько, Егоров, 1991; Белова и др.1995; Брильков,1996; Shapiro,Higgins,1989). В их числе находятся и физические методы исследования биообъектов, среди которых подавляющим преимуществом обладает электронная микроскопия. Разнообразные методы электронной микроскопии позволяют оценить гетерогенность с позиций клеточной биологии, биохимии, генетики и биофизики (Шапиро, 1988; Лихошвай, Христолюбова, 1988), т.е. одновременно наглядно продемонстрировать гетерогенность на субклеточном, клеточном и популяционном уровне. Цель п задачи исследования.

Цель исследования заключалась в развитии представлений о структуре и гетерогенности бактериальных колоний на примере водородокисляющих Alcaligenes eutrophus 21 и светящихся бактерий Photobacterium leiognathi шт. 54, возможности использования полученных морфологических характеристик как управляемых параметров популяции. В конкретные задачи работы входило:

1. Развитие метода приготовления целых бактериальных колоний для электронно-микроскопических исследований светящихся и водородокисляющих бактерий.

2. Оценка влияния физико-химических факторов среды на морфологические характеристики клеток и их пространственную локализацию в объеме колоний вариантов P.leiognathi шт.54 и A.eutrophus niT.Zl.

1. Сравнительный анализ архитектоники колоний как параметра, характеризующего штамм, вид, род и т.д.

2. Определение роли метаболической активности клетки, действия декомпактизующих ДНК факторов, HU белка в гетерогенности бактериального хроматина.

Научная новизна работы и практическое значение.

Настоящая работа является комплексным исследованием, в результате которого получены новые данные и сформированы новые представления о цитоморфологической гетерогенности популяций и структурной организации бактериальной колонии, зависимости фенотипических характеристик от физико-химических факторов среды. Результаты работы являются существенным продвижением в развитии представлений о временной и пространственной организации биологических систем, в частности, принципов самоорганизации бактериальных колоний как сообщества на твердой поверхности.

Впервые на примере A.eutrophus Z1 и P.leiognathi шт.54 проведено исследование архитектоники бактериальных колоний с применением метода, позволяющего сохранять целостность колонии. При анализе панорамных (обзорных) снимков больших участков колоний, полученных с помощью просвечивающего электронного микроскопа, получены принципиально новые данные о существовании морфологически гетерогенных субпопуляций бактерий в составе одной колонии и их определенной пространственной локализации. Впервые изучено тонкое строение микроорганизмов в колониях диссоциантов водородокисляющих и светящихся бактерий. По ультраструктурной организации идентифицированы определенные морфотипы данных бактерий. Показано, что морфологические признаки колоний определяются сочетанием составляющих ее морфотипов клеток.

Исследование структуры нуклеоида водородокисляющих бактерий показало необычайно высокую степень компактизации хроматина, стабильность обнаруженных уровней упаковки на препаратах выделенное ДНК. Результаты исследования степени компактизации бактериальное хромосомы водородокисляющих бактерий расширяют аналогии і структурной организации геномов про- и эукариот, подтверждают представления о зависимости структурной организации хроматина от

физиологического состояния бактериальной клетки. Впервые проведенная для A.eutrophus Z1 и P.leiognathi 208 на электронно-микроскопическом уровне иммуноцитохимическая локализация гистоноподобного белка HU на хроматине бактерий in situ свидетельствует об участии данного белка в организации вторичной структуры бактериальной ДНК

Полученные результаты о фенотипических характеристиках популяций водородокисляющих и светящихся бактерий, о функциональной активности генома могут найти приложение в изучении микробного разнообразия, экологии микроорганизмов, в изучении динамики структуры популяции, механизмов действия на нее внешних факторов. Отсюда вытекает возможность прогнозировать изменение состава популяции и тем самым управлять ею. Кроме того, полученные результаты могут иметь практическое значение при создании штаммов-продуцентов биологически активных и ценных веществ, получении различных тестовых систем на основе бактерий. Положения, выносимые на защиту.

1. Колонии светящихся и водородокисляющих бактерий являются неоднородными по структуре составляющих их клеток. По мере развития колонии вдет дифференцировка клеток по определенной программе.

2. .Архитектоника колоний повторяема, т.е. наследственно закреплена.

3. Структурная организация хроматина водородокисляющих бактерий характеризуется высокой степенью компактизации и стабильностью выделенных уровней при различном метаболическом состоянии клетки.

4. Гистоноподобный белок HU участвует в поддержании нуклеосомоподобного уровня организации ДНК ( на примере A.eutrophus Z1 и P.leiognathi шт.208).

Апробация работы. Материалы исследований были доложены на Всесоюзной конференции «Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов» (Пущино,1987), XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), заседании Красноярского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Красноярск, 1987), заседании Московского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Москва, 1990), Всесоюзной школе «Электронная микроскопия в биологии и медицине» (Звенигород, 1990), Всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций» (Алма-Ата, 1991), Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996), конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 1996), VIII Европейском конгрессе по биотехнологии'-^! (Будапешт, 1997).

Структура и объем работы.