Введение к работе
Актуальность темы. Изучение поведения одноцепочечной ДНК (ssflHK) в растворе важно для понимания процессов передачи генетической информации и репликации ДНК. Известно, что в некоторых бактериофагах молекула ДНК существует в виде одноцепочечной структуры. Результаты исследований, проведенных в последнее время, свидетельствуют о высоком сродстве и избирательном связывании ароматических лигандов - антибиотика актиномицина D и акридиновых красителей с вэДНК. Для прогнозирования медико-биологических свойств антибиотиков и целенаправленной разработки новых лекарственных средств, для понимания механизма функционирования антибиотиков на молекулярном уровне необходимо использование различных теоретических и экспериментальных методов исследования. Одним из наиболее эффективных экспериментальных методов для изучения молекулярных комплексов в растворе является ЯМР-спектроскопия. На основе метода ЯМР-спектроскопии, который по информативности в настоящее время сравним с рентгеноструктурным анализом, установлены структуры ряда комплексов биологически активных веществ с самокомплементарными олиго-нуклеотидными последовательностями. Вместе с тем, практически отсутствуют в литературе данные по комплексообразованию лигандов с одноцепочечными фрагментами нуклеиновых кислот. Это связано с тем, что в разбавленном водно-солевом растворе ббДНК может находиться в различных конформационных состояниях, в частности, наряду с внутримолекулярными связями между азотистыми основаниями в одноцепочечной ДНК могут возникать и межмолекулярные связи. Один из путей решения этой проблемы - использование модельных соединений - фавнитеяьно коротких несамокомплементарных дезокситетрануклеотидов различной последовательности оснований в цепи. Экспериментально установлено, что специфичность связывания ароматических лигандов с нативной ДНК проявляется уже на коротких самокомплементарных олигонуклеотидах, включающих в себя соответствующий участок. Следовательно, можно ожидать, что необходимые энергетические и структурные характеристики комплекса лигандов с ssflHK в растворе могут быть выявлены путем изучения их взаимодействия с малыми фрагментами одноцепочечных нуклеиновых кислот - несамокомплементарными олигонуклеотидами заданной последовательности оснований.
Цель исследования, проведенного в диссертационной работе - установить
основные закономерности интеркаляционного взаимодействия ароматического ли
ганда бромистого этидия с одноцепочечными дезокситетрануклеотидами различ
ной последовательности оснований в водно-солевом растворе. Выяснить влияние
нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи на: особенности
процессов комплексообразования ароматического лиганда и ssflHK. Для достиже
ния поставленной цели решались задачи: расшифровки и отнесения сигналов про
тонов в одномерных и двумерных спектрах растворов некомплементарных дезокси-
тетрануклеотидов и бромистого этидия; изучения закономерностей самоассоциации
ароматических лигандов, одноцепочечных дезокситетрануклеотидов различной по
следовательности оснований; разработки методик определения структурных и тер
модинамических параметров ассоциации и комплексообразования ароматического
лиганда с некомплементарными олигонуклеотидами на основе концентрационных
и температурных зависимостей протонных химических сдвигов; изучения комплек
сообразования фенантридинового красителя бромистого этидия с одноцепочечны
ми тётрамерами различного нуклеотидного состава и последовательности основа
ний в цепи, установление основных типов образующихся комплексов, их структуры
и термодинамических характеристик; анализа характера физико-химических вза
имодействий, ответственных за селективность связывания ароматического красите
ля с одноцепочечными компонентами нуклеиновых кислот. : .,.
Научная новизна определяется результатами, входящими в основные положения, выносимые на защиту: - впервые на основе использования методов одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии проведено комплексное и систематическое исследование взаимодействия в водном растворе типичного интеркалятора бромистого этидия со специально синтезированными синтетическими несамоком-плементарными дезокситетрануклеотидами различной последовательности оснований в цепи; - показано, что содержание различного типа комплексов в растворе существенно зависит от соотношения исходных концентраций взаимодействующих молекул и последовательности оснований в цепи несамокомплементарных дезокситетрануклеотидов. Степень связывания бромистого этидия с одноцепочечными молекулами тегрануклеотидов зависит от нуклеотидного состава, последовательности оснований в цепи, а также от типа нуклеотидов, фланкирующих участки преимуще-
ственной посадки красителя; - разработана методика расчета структур комплексов красителя с одноцепочечными тетрануклеотидами по предельным значениям протонных химических сдвигов взаимодействующих молекул. Определены пространственные структуры 1:1 и 2:1 комплексов бромистого этидия с одноцепочечными дезокситетрануклеотидами, проведен сравнительный анализ геометрических особенностей комплексов молекул в растворе; - разработана методика определения термодинамических параметров комплексообразования ароматического лиганда с дезоксиолигонуклеотидами, основанная на температурных зависимостях протонных химических сдвигов красителя в водном растворе, позволяющая дифференцированно определить вклады различного типа реакций в суммарные тепловые и энтропийные эффекты. Определены термодинамические параметры (свободные энергии Гиббса, энтальпии и энтропии) реакций комплексообразования бромистого этидия с несамокомплементарными дезокситетрануклеотидами d(AAGC), d(GAAG), d(CGAA) и d(CTGA) в водном растворе, сделан вывод о характере физико-химических взаимодействий, ответственных за селективность связывания красителя с различными сайтами исследованных одноцепочечных последовательностей.
Научная и практическая ценность работы. Полученные в работе экспериментальные и теоретические результаты углубляют существующие представления о взаимодействии биологически активных низкомолекулярных веществ с генетическим материалом клетки. Многие низкомолекулярные ароматические лиганды обладают хнмиотерапевтическими свойствами, в том числе и антиканцерогенной активностью, в частности, бромистый этидий обладает трипаноцидными свойствами. Для выяснения механизма селективного связывания ароматических лигандов с од-ноцепочечной ДНК изучено комплексообразование типичного интеркалятора бромистого этидия с модельными несамокомплементарными олигонуклеотидными последовательностями, отличающимися нуклеотидным составом и последовательностью оснований в цепи. Такие исследования важны для выяснения роли лигандов в процессе транскрипции и репликации ДНК. Использование методов одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии позволило выполнить детальный анализ структурных и термодинамических характеристик комплексообразования одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот с фенантридиновым красителем в растворе. Исследования показали, что характерные особенности взаимодействия молекул.
4 специфика связывания бромистого этидия с определенными участками одноцепо-чечных нуклеиновых кислот проявляется уже на коротких нуклеотидных последовательностях. Подобные исследования важны для понимания молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот с белками и другими биологически важными соединениями, для установления общих принципов избирательного взаимодействия лигандов с генетическим материалом клетки.
Конкретный вклад диссертанта: подбор, обработка и анализ литературных данных; постановка научной задачи, выбор и реализация аналитических и численных методов ее решения; расшифровка и отнесение сигналов протонов в одномерных и двумерных спектрах растворов исследуемых молекул; участие в разработке методик определения структурных и термодинамических параметров ассоциации и комплексообразования молекул на основе концентрационных и температурных за-висимотей протонных химических сдвигов; анализ и интерпретация полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты исследований, вошедших в диссертацию были представлены и обсуждены на: семинаре Химического общества им. Д.И. Менделеева "Молекулярная физика и биофизика,водных систем", г. Санкт-Петербург, 1995 г.; семинарах департамента физики и химии СевГТУ, г. Севастополь, (1994 -1997); Международной научной конференции^ посвященной 150-летию рождения И.Пулюя, г. Тернополь, май, 1995; Международной конференции по эк-периментальной ЯМР-спектроскопии, г. Париж, Франция, май, 1996; 12 биофизическом съезде, Амстердам, Голландия, август, 1996; XIII Національної Школи-Семінару з міжнародною участю "Спектроскопія молекул та кристалів", м. Суми, квітень, 1997; 13 Международная конференция по ЯМР-спектроскопии, г. Эксетер, Великобритания, июль, 1997. Тезисы перечисленных докладов опубликованы.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Структура диссертаций. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы, включающего 210 наименований. Материал изложен на 183 страницах, содержит 33 таблицы и 44 рисунка.