Молекулярные механизмы действия моторных белков мышечных и немышечных клеток Кулева, Надежда Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Проблема трансформации энергии АТФ в различные формы движения в биологических системах является одной из актуальных проблем современной биохимии, биофизики, биологии клетки. С 1939 года, когда В.А.Энгелыардт и М.Н.Любимова открыли способность основного сократительного белка мышц миозина катализировать гидролиз АТФ, это направление исследований развивалось по пути изучения закономерностей механохимии актомиозино-вой системы мышц и открытия новых классов молекулярных преобразователей энергии в немышечных клетках (моторных белков). К настоящему времени известны 15 классов миозинов из мышечных и немышечных клеток, суперсемейства клеточных динеинов и кинезинов, белки, осуществляющие перемещение вдоль нитей ДНК и РНК, вращательный мотор Н⁺-АТФ-синтаза. Исследование механизмов действия клеточных моторов исключительно важно, так как позволяет понять, каким образом осуществляются многие функции клетки: цитокинез, эндоцитоз, секреция, перемещение цитоплазмы и клеточных ор-ганелл Нарушение работы моторных белков ведет к патологии таких систем многоклеточного организма как двигательная слуховая, зрительная. Информация о механизмах функционирования клеточных моторов является основой для создания искусственных механохими-ческих машин с высоким коэффициентом полезного действия.

Несмотря на значительные усилия, многие детали молекулярного механизма, посредством которого химическая энергия преобразуется моторными белками в механическую работу, неизвестны. Полное понимание этого механизма должно включать выделение значимых ступеней механохимического цикла, определение структуры моторных белков в соответствующих состояниях, определение кинетики переходов и перепадов свободной энергии между ними. К настоящему времени значительный прогресс в исследовании моторных белков мышц делает эту задачу вполне осуществимой. В работах с очищенными белками идентифицировано значительное количество интер-медиатов механохимического цикла, изучена его кинетика и энергетика (Cooke 1997). Показано что аналогичные интермедиа образуются в кинетическом цикле активированных мышечных волокон. Важной задачей остается изучение интермедиа механохимического цикла других клеточных моторов.

Определение кристаллической структуры головки миозиновой молекулы (моторного домена миозина) в комплексе с нуклеотидами методом высокоразрешающего рентгено-структурного, анализа дало четкую информацию о конформационных изменениях, происходящих на определенных этапах механохимического цикла (Payment et al., 1993; 1996). Такого рода данные вместе с другими показателями по-

зволили создать модель, демонстрирующую, каким образом конфор-мационные изменения моторного домена связаны с генерацией силы. На уровне белковых препаратов было показано, что начальный этап взаимодействия миозина скелетных мышц кролика с АТФ сопровождается значительным изменением свободной энергии и конфор-мации молекулы (Wolcott, Воуег, 1974). Белок переходит в особое ме-тастабильное состояние, характеризующееся взаимопревращением прочносвязанного комплекса миозина с АТФ и комплекса белка с продуктами гидролиза (АДФ и Фн). Этот процесс можно зарегистрировать по интенсивности реакции изотопного обмена кислорода между Н2¹⁸0 и Фн- Изучение кинетики включения

^8Q

непосредственно в указанные комплексы подтвердило их ключевую роль в механизме гидролиза АТФ миозином (Webb Trentham 1981) Актуальными остаются вопросы о том образуются ли подобные комплексы при гидролизе АТФ другими клеточными моторами имеются ли особенности в катализе гидролиза АТФ миозинами различного происхождения и какие реактивные аминокислотные остатки моторного домена миозина участвуют в образовании комплексов миозина с нуклеотидом и неорганическим

В системе, включающей все компоненты, необходимые для ме-ханохимического превращения, характер конформационных изменений в моторном домене миозина зависит от стадии гидролиза АТФ и определяет характер взаимодействия головки миозина с актиновой нитью. Различают состояние слабого связывания, когда в активном центре находится АТФ или продукты его гидролиза, и состояние прочного связывания после диссоциации Фн из активного центра, в этом состоянии происходит генерация силы. До сих пор не вполне ясно, взаимодействие каких участков моторного домена миозина с актиновой нитью соответствует различным состояниям системы, в том числе и стадии генерации силы; является ли нить Ф-актина активным участником механохимического процесса и какого рода изменения происходят в ней при взаимодействии с мотсюным доменом миозина Одним из наиболее адекватных методов исследования структурных изменений в актиновой нити является регистрация методом поляризациой-ной (Ьлуориметрии перемещения сЬлуоресиентных зондов связанных с определенными участками мономера акт7на

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы является сравнительный анализ механизмов взаимодействия с АТФ и актином моторных белков различных систем биологической подвижности.

Конкретными задачами работы были следующие:

1. Сравнить механизмы гидролиза АТФ в системах миозиновой и динеиновой подвижности (по критерию изотопного обмена кислорода).

1. Провести сравнительную оценку механизмов АТФазной реакции, катализируемой миозинами из разных типов мышц и немышечных клеток.

2. Исследовать влияние блокирования реактивных аминокислотных остатков миозина на интенсивность ¹⁸0-обменных реакций, характеризующих взаимопревращение интермедиатов гидролиза АТФ.

3. Оценить роль различных участков моторного домена миозина в индуцировании конформационных изменений в актиновой нити.

4. Сравнить характер конформационных изменений в актиновой нити при связывании моторного домена миозина для различных систем биологической подвижности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В механизме гидролиза АТФ миозином различного происхождения и динеином аксонем жгутов морского ежа общими интермедиа-тами являются Е-АТФ и ЕАДФФ„ (где Е - активный центр фермента).

2. Миозины млекопитающих и птиц имеют различия в функцио^ нировании аденозинтрифосфатазного центра, проявляющиеся в различной зависимости интенсивности ¹⁸0-обмена от двухвалентного катиона.

3. Время существования интермедиата ЕАДФФн в ходе гидролиза зависит от конформационного состояния участка С-концевого фрагмента моторного домена миозина, несущего SH1-rpynny.

4. В индукции специфических конформационных изменений в актиновой нити на стадии прочного связывания с ней моторного домена миозина важную роль играет участок С-концевого фрагмента, связанный со щелочной легкой цепью.

5. Характер конформационных изменений в актиновой нити при прочном связывании моторного домена не зависит от происхождения миозина или актина.

Научная новизна полученных результатов.

Впервые произведено сравнение механизмов гидролиза АТФ (по данным изотопного обмена кислорода) для миозиновои и динеиновои АТФаз. Показано сходство механизма гидролиза, состоящее в образовании нековалентно связанных интермедиатов с субстратом и продуктами гидролиза и различие, определяющееся стабильностью образующихся интермедиатов.

По зависимости интенсивности реакции изотопного обмена кислорода от кофактора иона двухвалентного металла впервые произведено сравнение функционирования активного центра миозина млекопитающих (скелетных мышц кролика, гладких мышц кишечника и немышечных клеток тимуса теленка) и птиц (скелетных мышц 15-тидневного куриного эмбриона и цыпленка). Показано сходство исследованных параметров у различных миозинов млекопитающих и отли-

чие - у миозина птиц, интерпретируемое как сходство и различие соответствующих активных центров.

Впервые показано, что блокирование реактивных лизиновых, цистеиновых и гистидиновых аминокислотных остатков, связанное с конформационными изменениями в районе конвертерного участка С-терминального фрагмента головки миозина, оказывает дестабилизирующее влияние на комплекс миозина с продуктами гидролиза М** АДФ-Фн (по данным изотопного обмена кислорода), а удаление регу-ляторных легких цепей такого влияния не оказывает.

На основании данных о влиянии паранитротиофенилирования миозина на изотопный обмен кислорода сделано предположение о важной роли глутаматного остатка активного центра миозина (возможно, Glu 264) во взаимодействии элементов молекулы воды с у-фосфатомАТФ.

По изменению параметров поляризованной флуоресценции зондов, связанных с актиновой нитью, впервые показано, что конформа-ционные изменения актина, происходящие в ответ на ригорное связывание головки миозина, не зависят от интактного состояния участка "слабого" связывания актина или других участков центрального фрагмента головки (м.м. 50 кДа), а определяются взаимодействием с участками С-концевого сегмента головки и связанных с ним щелочных легких цепей. При этом изменение ориентации флуоресцентного зонда связанного с SHI-группой в конвертерном участке моторного до-мена, согласовано с изменением конформации в области С-концевого участка мономера актина.

Впервые показано, что характер конформационных изменений в актиновой нити в ответ на ригорное связывание головки миозина не зависит от происхождения миозина или актина и аналогичен для миозина гладких и скелетных мышц и актина скелетных мышц и немышечных клеток.

Впервые исследовано влияние неэнзиматического гликозилиро-вания актина in vivo и in vitro на его функциональные свойства.

Научно-практическая значимость

Исследование механизмов биологической подвижности актомио-зинового типа, проведенное в настоящей работе, вносит вклад в решение общебиологической проблемы двигательной активности живых клеток. С одной стороны, продемонстрированные в работе молекулярные механизмы гидролиза АТФ и взаимодействия моторного домена сократительного белка с субстратом движения могут иметь аналогии у других клеточных моторов. С другой стороны, обнаружение универсального характера конформационных изменений в актине в ответ на связывание моторного домена миозина подтверждает гипотезу об активной роли CTDVKTVDbi актина при осуществлении мышеч-ных и немышечных форм подвижности, а также функционировании

цитоскелета. В связи с этим в работе исследован вопрос о нарушении структуры и функции актина за счет процесса, усиливающегося в организме при гипергликемии - неэнзиматического гликозилирования.В работе показано, как меняются функциональные свойства актина при гликозилировании in vivo и in vitro. В работе также показано применение метода ¹⁸0-обменных реакций для идентификации аденозинтри-фосфатазы в соответствии с характером образующегося интермедиа-та. Полученные данные были использованы в отделе биохимии нервной системы Института биохимии имени А.В. Палладина (Украина, Киев) и на кафедре биофизики Киевского государственного университета имени Т Г.Шевченко для характеристики ферментов из нервной и мышечной ткани.

Представленные в работе данные были использованы при чтении курсов лекций "Молекулярные основы подвижности" и "Биохимическая адаптация", а также в магистерской программе "Биохимия адаптации" на кафедре биохимии Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на I, 11, III, IV, V, VI, VII Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии мышц (Тбилиси, 1968; Ереван, 1971; Тбилиси, 1974; Киев, 1977; Львов, 1980; Тбилиси, 1983; Пущине, 1987), на Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1966, 1972, 1981; Тбилиси, 1989; Телави, 1985), на II, III, IV ,V Всесоюзных биохимических съездах (Ташкент, 1969; Рига, 1974; Ленинград, 1979; Москва, 1986; Ленинград, 1991), на Всероссийской конференции по биохимии и биофизике мышечного сокращения (Пущине, 1996), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на V Всесоюзной школе по биологии мышц (Харьков, 1988), на XI XII Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972), и на KoHrpeccaхFEBS (Будапешт 1974; Париж 1975; Копенгаген, 1977; Эдинбург 1981) на Советско-Американских симпозиумах по кардиологии (Ташкент 1989; Баку 1984) на Международной конференции "Молекулярная организация биологических структур" (Москва 1989) на Международной конференции стран-членов СЭВ и СФРЮ по молекулярным механизмам и энергетике подвижности (София 1989) на XIX Европейской мышечной конференции (Голландия 1989) на XXXIII Международном Конгрессе по физиологическим наукам (Санкт-Петербург 1997) на III Международном конгрессе по патофизиологии (Финляндия 1998) на Международно мСимпозиуме "Биологическая подвижность Современна мS исследований (Пущинр 1998) на городском свинаре,"Цитоскелет" вИнституте цитологии РАН (Санкт-ПетербуоГ 1997) на Научной сессии Эфедры биохимии Санкт-Петербур скогсГ университета поа^итП^п^юзттолотіл

(Санкт-Петербург 1998), на II съезде биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 53 научных работы в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем работы