Содержание к диссертации
Введение
I. Аппарат транскрипции у эукариот 8
1 Транскрипция у эукариот. РНК-полимеразы 8
2. РНК-полимераза II. 9
3. Области контроля транскрипции 10
Промотор 10
Проксимальные и дистальные элементы. Энхансеры 13
LCR.MAR 15
4. Инициация mpancKpumfUU РНК-полимеразой II 16
II. Транскрипционные факторы 19
1. Компоненты транскрипционного аппарата 19
2. Общие факторы транскрипции (GTFs) 21
ТВР 21
TFIIB 23
TFIIF 23
TFIIH 23
TFIIE 24
TFIIA 24
3. Активаторы и репрессоры 24
ДНК-связывающие домены 26
Активациониые и репрессионные домены 26
4. Корегуляторы 27
TFIID 29
TAFs 30
USA 33
Медиатор 34
III. ХРОМАТИН 36
1. Хроматин и транскрипция 36
2. Гетерохроматин иэухроматин 38
3. Хроматин-ремоделирующие комплексы 40
SWI/SNF группа 40
ISWI группа 41
NuRD 42
Механизмы ремоделинга хроматина 42
4. Хроматии-модифихщрующие комплексы 43
Гистоновый код 43
Гистонацетилтрансферазы 45
SAGA 47
СВР. р 160 семейство 48
Гистондеацетилазы 49
5. Взаимодействие хроматин-ремоделирущих и модифицирующих комплексов 50
IV. Функционирование аппарата транскрипции IN VIVO 50
1. Модульная структура транскрипционного аппарата 50
PHD 51
AT-hook 53
2. Комбинаторная модель регуляции транскритии. Синергизм действия и контекст-зависимая активность факторов транскрипции 54
3. Регуляция транскрипции 57
4. Регуляция активности транскрипционных факторов 58
5. Репрессия транскрипции и сайленсинг 60
6. Инициация транскрипции in vivo 62
7 Организация ядра и траискрит^ия 66
Экспериментальная часть 69
I. Объект и задачи исследования 69
Ii. Материалы и методы 72
1. Реактивы 72
2. Работа с дрозофилами 72
3. Программное обеспечение. Базы данных. 72
4. Работа с ДНК 72
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной ДНК, Рестрикция, лигировапие, переосаждение ДНК, гель-электрофорез 72
PCR 73
Секвепирование ДНК 75
Секвенирование летального аллеля 75
Саузерн-гибридизация , 75
Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд 76
Клонирование гена е(у)3 76
5. Работа с РНК 76
Выделение тотальной РНК 76
Очистка polyA+РНК 76
Получение кДНК, RT-PCR 76
Нозери анализ 77
6. Работа с белками 78
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 78
Получение антител и их очистка 78
Белковый гель-электрофорез 79
Иммуноблоттинг 79
Иммунопреципитация 79
Dot-blot 80
Выделение эмбрионального ядерного экстракта 80
Фракционирование ядерных белков 80
Получение белковых экстрактов из эмбрионов , 80
Хроматография , 80
7. Гибридизация in situ 80
Гибридизация срезов in situ 80
Гибридизация политенных хромосом in situ 80
8. Иммуиоокрашивание 81
Иммуноокрашивание политенных хромосом 81
Иммуиоокрашивание ядер с удаленным хроматином 81
Иммуноокрашивание срезов 81
Иммуноокрашивание эмбрионов 81
III. РЕЗУЛЬТАТЫ 82
1. Геномная характеризация гена e(y)3 82
Клонирование гена е(у)3 82
Изучение структуры гена е(у)3 82
Геномная характеризация аллеля е(у)Зи 83
Получение и характеризация новой мутации е(у)3 83
Картирование других мутаций гена е(у)3 83
2. Изучение структуры транскриптов гена е(у)3 . 85
Изучение структуры с помощью Нозерн-гибридизации 85
Картирование с помощью RT-PCR 85
Изучение структуры транскриптов у мутантов е(у)Зи1 и е(у)3ЕШ1 85
ESTs изучаемого гена , . 86
3. Структурный анализ SAYP 89
Анализ первичной структуры SAYP . 89
Гомологи SAYP. Консервативный домен SAY 90
Получение антител к белку , , 91
Иммуноблоттинг , , 91
Внутриядерное распределение SAYP 92
4. Анализ экспрессии гена е (у)3 98
Нозерн развития 98
Нозерн тканей , 98
Гибридизация in situ 98
Иммуноокрашивание срезов тканей 98
Иммуноокрашивание эмбрионов и личинок 98
5. Участие SAYP в транскрипции 103
Локализация на политенных хромосомах 103
Хроматографическая очистка 103
СоГР 104
IV. Обсуждение результатов 109
Выводы 117
Благодарности 118
Список литературы
- Проксимальные и дистальные элементы. Энхансеры
- Активациониые и репрессионные домены
- AT-hook
- Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд
Введение к работе
Актуальностыпемы
Реализация наследственной информации - процесс, привлекающий в последнее время внимание все большего числа исследователей. Изучение молекулярных механизмов этого процесса ведется уже около 50 лет с помощью разнообразных физико-химических и математических методов. В последнее время благодаря интенсивному развитию последних удалось решить проблему чтения генетической информации. К настоящему моменту прочитаны геном человека, многих видов эукариот и прокариот. Однако во многом прочитанная информация остается для нас непонятной. Эта трудность функциональной интерпретации полученных данных и приводит к усилению интереса к молекулярному аппарату, осуществляющую в клетке чтение и реализацию имеющейся в ней генетической информации.
Понимание принципов работы этого аппарата, вместе с накопленными данными о структуре самих генов, позволит как решить ряд фундаментальных вопросов биологии и генетики в частности, так и поднять на качественно новый уровень практическое применение имеющихся знаний в медицине, фармакологии, биотехнологии, селекции.
Реализация генетической информации в клетке представляет собой сложный многостадийньш процесс. Считается, что именно первый этап -транскрипция - является наиболее важным в регуляции всего процесса экспрессии генов. К настоящему моменту исследовано большое количество разнообразных факторов, формирующих аппарат транскрипции. Однако имеющаяся схематичная картина работы факторов в ядре постоянно детализируется и корректируется благодаря большому объему вновь
I *'U& НАЦИОНАЛЬНАЯ?
появляющихся исследований, посвященных факторам транскрипции и другим белкам ядра.
В проведенной работе дается характеристика нового фактора транскрипции выспшх эукариот SAYP и кодирующего его гена е(у)3 на примере хорошо изученного модельного организма Drosophila melanogaster.
Цельизадачиисследования Основной целью данной работы являлась молекулярная характеризация нового транскрипционного фактора и кодирующего его гена. В ходе исследования предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:
клонирование гена е(у)3,
изучение структуры гена е(у)3 и характеризация его транскриптов,
изучение молекулярных основ мутации е(у)Т',
получение других мутаций е(у)3 и изучение их молекулярных основ,
исследование экспрессии е(у)3 в процессе развития,
изучение структуры SAYP,
молекулярная характеризация SAYP как участника процесса
транскрипции, поиск его партнеров среди компонентов
транскрипционного аппарата.
Научнаяновизнаипрактическаяценностьработы
В работе изучен новый ген е(у)3 и кодируемый им фактор транскрипции
SAYP. Ген е(у)3 клонирован, получен его новый аллель. Показано, что
фактор SAYP имеет гомологов у высших эукариот, в том числе в организме
человека. В их составе был обнаружен новый консервативнії домен.
Показано, что SAYP - новый коактиватор РНК-полимеразы П, необходимый для транскрипции многих генов эухроматина, тесно взаимодействующий с рядом основных факторов транскрипции. Одновременно обнаружено значительное количество SAYP в перицентрическом гетерохматине.
Таким образом, в работе охарактеризован новый важный участник процесса транскрипции высших эукариот.
Апробацияработ ы Результаты работы были представлены на XIV Зимней Международной молодежной Научной Школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), на Ш Международном Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), на Международной Конференции "Molecular Genetics of Eucariotes", (Москва, 2003), на конференции молодых ученых по Молекулярной Биологии и Генетике (Киев, 2003) и на Межуднародной Конференции "Advances in Molecular Cell Biology" (Москва, 2004).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 тезисов докладов.
Объем иструктурадиссертации Диссертация изложена на 135 страницах и состоит из разделов Введение, Обзор литературы, Объект и задачи исследования, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Выводы и Список литературы, содержит 15 рисунков. Библиография включает 185 источников.
Проксимальные и дистальные элементы. Энхансеры
Полный набор факторов, требующийся для инициации транскрипции, известен в настоящее время только для TATA промоторов. В то же время известно, что РІС, собирающиеся на разных типах промоторов, отличаются составом. Факторы, специфичные для лишенных ТАТА промоторов, изучены слабо.
И на содержащих, и не содержащих ТАТА промоторах базальная транскрипция осуществляется только в присутствии TAFs [9]. Считается, что именно они являются основными факторами, различающими типы промоторов. Кроме того, известен фактор NC2, способный различать TATA и DPE промоторы [10]. Факторы TIC-2 и TIC-3 требуются для инициации транскрипции с Inr-содержащих промоторов [11]. Возможно, TRF-содержащие комплексы также вносят вклад в различение промоторов [12].[13] GTFs, кроме ТВР и TFIIB, обладают ограниченной степенью сиквенс-специфического взаимодействия с ДНК и поэтому не вносят большого вклада в различение промоторов.
Возможным механизмом селективного узнавания промоторов без участия специализированных факторов является различие параметров формирования РІС на разных промоторах. Так, TFIID комплекс связывается с гораздо большей аффинностью с TATA-Inr и DPE-Inr промоторами. Активаторы могут облегчать прохождение скорость-лимитирующей стадии сборки РІС на одном типе промотора и не влиять на эту стадию на другом. На разных типах промоторов TFIID комплекс, вероятно, имеет различную конформацию и поэтому компетентен к действию разных активаторов [б]. Даже in vitro имеется целый спектр механизмов сборки РІС [14].
Обычно промотор в составе хроматина не связан с транскрипционными факторами. Однако, например, на промоторах генов теплового шока у дрозофилы собираются комплексы общих факторов транскрипции и РНК-полимеразы, инициирующих транскрипцию только при появлении определенных регуляторных белков [15].
Дополнительный уровень регуляции транскрипции гена - наличие нескольких промоторов. Так, ген Hunchback имеет как промотор, обеспечивающий убиквитарную экспрессию, так и промотор, обеспечивающий экспрессию в ограниченной области у ранних эмбрионов [16]. Разные промоторы могут выполнять следующие функции: контролировать уровень транскрипции, эффективность трансляции, регулировать тканеспецифичность экспрессии и давать набор вариантов белка, отличающхся по N-концу [17].
Проксимальные и дистальные элементы. Энхансеры. Проксимальные элементы располагаются непосредственно выше базальных элементов промотора, в положении от -50 до -200 пар оснований по отношению к точке старта транскрипции (также эти элементы в совокупности получили название регуляторный промотор [2]). У дрожжей большинство генов имеет один регуляторный участок такого типа, называемый UAS / URS (upstream activating / regulating sequence), расположенный за несколько сот пар оснований до промотора. Обычно данные элементы сохраняют свое действие при изменении расстояния до промотора в пределах нескольких десятков нуклеотидов.
Проксимальные элементы содержат многочисленные сайты связывания группы специфических транскрипционных факторов (активаторов и репрессоров), к которым относятся, в частности, Spl, CTF/NF-1, CBF/NF-Y. Однако в данном контексте эти факторы действуют не как классические активаторы и репрессоры, а скорее необходимы для привлечения к промотору основных регуляторных областей -дистальных элементов - энхансеров. В частности, данные факторы важны для выбора определенного энхансера из их набора, регулирующих ген [16].
Дистальные элементы удалены от промотора на расстояния от 200 до нескольких десятков тысяч пар оснований, причем располагаться они могут как выше, так и ниже промотора. К таким элементам относятся энхансеры и сайленсеры. Проксимальные и дистальные элементы обладают, видимо, сходным механизмом действия и представляют собой по сути два крайних предела расположения регуляторных элементов. В настоящее время найдены элементы, расположенные в промежуточных положениях. Для многих проксимальных и дистальных элементов показана тканеспецифичность проявления [3].
Энхансерами называют определенный класс регуляторных последовательностей н (от 50 до 200 Ьр), которые способны увеличивать уровень транскрипции с промотора в цис-положении (на той же молекуле ДНК) на больших расстояниях от него (от 10 kbp у дрозофилы до 100 kbp у млекопитающих). Энхансеры оказывают действие независимо от ориентации по отношению к промотору, а также от расположения относительно регулируемого гена. Аналогичным образом действуют сайленсеры - регуляторные элементы, которые оказывают негативное влияние на процесс инициации транскрипции. Обычно каждый ген у многоклеточных организмов контролируется несколькими энхансерами. Типичный энхансер животных - это участок 50 Ьр, содержащий порядка десяти сайтов связывания специфических факторов, обычно -трех, два из которых - активаторы и один - репрессор. Несколько энхансеров одного гена работают независимо друг от друга [16].
Энхансеры являются своеобразными матрицами для сборки сложных белковых комплексов из активаторов (репрессоров), компонентов ремоделирующих комплексов и белков хроматина. Эти комплексы через высокоспецифичные белок-белковые взаимодействия осуществляют передачу регуляторных сигналов РНК-полимеразе, находящейся в составе РІС и тем самым регулируют транскрипцию генов. Энхансеры соединяются в ядре с промотором благодаря образованию петли в ДНК, разделяющей их [1,2].
Сайленсеры, по-видимому, запускают сборку гетерохроматин-подобных структур на подконтрольных генах. Такой механизм показан у дрожжей для локуса, контролирующего тип спаривания. У высших организмов, вероятно, также имеются другие механизмы [2]. LCR. MAR.
В ряде случаев показано, что целый набор генов может находиться под контролем не только указанных выше элементов, но и так называемый LCR - сайта, контролирующего структуру хроматина и доступ активаторов к ДНК на протяженном участке (до 100 kbp). Общими свойствами различных LCR, как было выяснено в модельных системах, являются: - придание высокого уровня активированной экспрессии связанным с ними генам, - усиление действия с увеличением количества копий LCR, - перевод хроматина в открытое состояние на протяженных участках ДНК, - придание экспрессии контролируемых генов независимости от окружающего гетерохроматина.
Часть свойств LCR напоминает свойства энхансеров: тканеспецифичность действия, способность связывать факторы транскрипции. Однако эти два типа сайтов четко различаются. Механизм действия LCR до конца неясен, но предполагается, что в ядре они образуют контакты с энхансерами и промоторами контролируемых генов, в результате чего последние получают способность выполнять свои функции [2].
Области, контролирующие транскрипцию - энхансеры, LCR - могут оказывать свое действие на больших расстояниях. Элементами, ограничивающими их влияние на определенный набор генов, являются инсуляторы (пограничные элементы) и MARs (SARs). Инсулятор, помещенный между энхансером и промотором, блокирует их взаимодействие
Активациониые и репрессионные домены
Обычно AD отличаются повышенной частотой встречаемости определенного аминокислотного остатка. Так, большинство AD дрожжей обогащены кислыми остатками, подобные кислые AD встречаются практически у всех эукариот (например, факторы TCF11, YY1). У дрозофилы и позвоночных найдены Gin- (Sp3, Oct-2), Ser/Thr-(Mll, Egr-1) и Pro- (CTF, AF-2) богатые AD. Поли-Gin стретчи, часто встречающиеся в транскрипционных факторах, проявляют себя как активаторы транскрипции. В то же время некоторые сильные AD не характеризуются повышенным содержанием какого-либо остатка.
Кислый AD не имеет четкой третичной структуры. Этот тип AD осуществляет свое действие при связывании с коактиваториым белком, при этом он приобретает более структурированную а-спиральную конформацию. Примером кислого AD служит AD активатора CREB, который подвергается фосфорилированию и затем связывается с коактиватором СВР.
Лиганд-связывающие домены ядерных рецепторов также выступают в качестве AD: коиформационные изменения в этих доменах, вызванные связыванием лиганда, открывают возможность взаимодействия с определенными коактиваторами и запуска транскрипции подконтрольных генов. Подобные домены, в отличие от предыдущих, имеют четкую третичную структуру. В любом случае решающую роль в функционировании AD играют специфические белок-белковые взаимодействия активатора и коактиватора [3].
Многие, если не все, активаторы обладают несколькими AD. Для активатора Gcn4 обнаружена избыточность двух AD: удаление одного AD практически пе влияет на способность активировать транскрипцию. Наличие нескольких доменов, видимо, как непосредственно увеличивает аффинность активатора по отношению к мишени (коактиватору), так и позволяет одному активатору связывать сразу несколько коактиваторов или GTFs [2].
Менее изучены репрессионные домены. Известны Ala, Pro-богатые, заряжепые RD. Лиганд-связывающие домены некоторых ядерных рецепторов представляют собой RD в отсутствие лиганда [3].
4. Корегуляторы
Первоначальное представление о том, что, как у прокариот, так и у эукариот транскрипционные регуляторы могут непосредственно вовлекать в места своего связывания общие факторы транскрипции и РНК-полимеразу, оказалось неверным. Было показано, что в клетках животных используется от 10 до 100 тысяч различных транскрипционных регуляторов, поэтому представить, что каждый регулятор имеет свою мишень в ограниченном наборе GTFs, кажется невозможным. Было высказано предположение о существовании еще одного уровня транскрипционных факторов, названных корегуляторами и служащих связующих звеном между специфическими регуляторами и общими факторами транскрипции. Это предположение было подтверждено обнаружением ряда активностей (белковых комплексов), поддерживающих индуцированную транскрипцию в опытах in vitro.
Для обеспечения взаимодействия достаточно ограниченного набора корегуляторных комплексов с множеством разнообразных активаторов и репрессоров, по-видимому, имеется 3 механизма: модификация и существование вариантов отдельных корегуляторов, тканеспецифичная экспрессия и альтернативные варианты сборки корегуляторных комплексов. Все эти возможности ясно прослеживаются на примере наиболее изученного комплекса TFIID (см. TFIID) [22].
Кроме указанной адапторной функции, корегуляторы осуществляют подготовку хроматинизированной матрицы к транскрипции. Таким образом, класс корегуляторов специфичен именно для эукариот, т. к. эукариотические организмы имеют сложную программу развития и, соответственно, большой набор специфических регуляторов транскрипции. Также для них характерно наличие хроматина.
Корегуляторы, согласно [22], можно классифицировать следующим образом: Сравнение корегуляторов различных видов показывает, что, в отличие от высококонсервативных общих факторов транскрипции, они обладают большим структурным и функциональными разнообразием. Видимо, уровень корегуляторов несет большую видоспецифичность: межвидовая гомология корегуляторов в ряде случаев может быть установлена в основном на функциональном уровне, как, например, в случае медиаторного комплекса. Кроме того, имеются специфичные именно для многоклеточных организмов корегуляторы: СВР, семейство pl60, NURF и RSF ремоделирующие комплексы; в свою очередь, нейрон-специфичный ремоделирующий комплекс BAF млекопитающих не имеет соответствующих гомологов у дрозофилы и нематоды [16, 22].
Коактиваторы представляют собой набор различных комплексов, которые могут иметь общие субъединицы (в частности, TAFs). В настоящее время к основным комплексам кофакторов-посредников активированной транскрипции относят TAFs в составе TFIID, компоненты так называемый USA и медиаторный комплекс [47]. Среди указанных корегуляторов особенно значимыми являются TAFs, проявляющие более широкий спектр транскрипционных активностей и участия в жизнедеятельности клетки по сравнению с компонентами других комплексов [9]. Имеются данные как об избыточности функций различных коактиваторов и пересечении их функций, так и о синергизме действия [47].
AT-hook
В настоящее время вопрос о том, каким образом имеющийся в клетке определенный набор транскрипционных факторов регулирует экспрессию гораздо большего количества генов в геноме, решается при помощи комбинаторной модели, заключающейся в следующем. Для многих активаторов показана способность формировать гетеродимеры, в которых два белка могут либо иметь одинаковые DBD и различные AD, либо отличаться и тем, и другим доменом. В зависимости от доступного репертуара транскрипционных факторов (в разных тканях) могут собираться различные комплексы активаторов. Три транскрипционных фактора в форме гетеродимера могут связываться с 6-ю различными сайтами и формировать б сложных активационных доменов. Для четырех факторов имеется 10 комбинаций, для 5 - 16 и т. д. Наличие одного репрессора, способного селективно связываться с одним из активаторов, "выводит из строя" сразу несколько сайтов связывания. В случае, когда один и тот же сайт может служить местом связывания активатора или репрессора, дифференциальная экспрессия последних может обуславливать действие этого сайта ДНК и как эихансера, и как сайленсера. Таким образом, комбинаторное взаимодействие факторов (как позитивных, так и негативных) как увеличивает число подконтрольных генов, так и дает больше возможностей для регуляции транскрипции. При таком механизме регуляции широко распрострапенным способом регуляции является модуляция способности факторов взаимодействовать друг с другом - например, через посттрансляционные модификации или различную локализацию партнеров. Комбинативный контроль в принципе невозможен для ситуации, когда экспрессия контролируется одним активатором (как это происходит у прокариот), поэтому указанные свойства - существенные характеристики транскрипции эукариот [2, 3].
TCRs (энхансеры) большинства генов представляют собой наборы расположенных рядом друг с другом сайтов узнавания активаторов и репрессоров. Транскрипция подконтрольных генов в результате зависит от конкретного набора функциональных регуляторов, имеющихся в ядре, а это, в свою очередь, определяется типом ткани, стадией развития организма и окружающими условиями. Для многих активаторов показана тканеспецифичность экспрессии [132]. Так, ген TTR млекопитающих экспрессируется в гепатоцитах, где его транскрипция контролируется по крайней мере пятью активаторами, три из которых имеются и в других клетках, а другие два специфичны для гепатоцитов [3]. Убиквитарный активатор Oct-1 связывается со своим сайтом достаточно прочно только в присутствии коактиваторов VP16 и ОСА-В, причем последний специфичен для В-лимфоцитов [46].
Связывание активаторов с энхансерами и другими TCR, как считается, происходит кооперативно: связывание факторов с ДНК взаимно усиливается благодаря белок-белковым взаимодействиям. Кооперативность, как считается, играет две роли: связывание определенного набора факторов с энхансером происходит только при наличии всех необходимых факторов; активация определенного гена может регулироваться очень малыми изменениями концентрации (или активности - например, фосфорилирования) фактора. Последнее открывает возможности тонкой регуляции активности гена.
Кооперативность связывания факторов с энхансерами приводит к сборке нуклеопротеиновых структур, названных энхансосомами. Энхансосомы проявляют два уровня специфичности, необходимых для активации генов. Во-первых, контекст-зависимые белок-белковые взаимодействия между активаторами обеспечивают кооперативную сборку комплекса. Во-вторых, энхансосома обладает специфичной поверхностью, комплементарной поверхности-мишени в основном транскрипционном аппарате и вовлекающей его для обеспечения синергичной транскрипции. Т. к. кооперативное взаимодействие часто зависит от точного расположения сайтов связывания факторов и определенного набора этих факторов, то каждый энхансер характеризуется уникальной сетью взаимодействий белок-ДНК и белок-белок. Поэтому при изучении работы фактора транскрипции in vivo важны как окружающий его сайт связывания контекст в ДНК, так и наличие других факторов. Это, в частности, обуславливает различение in vivo сайтов связывания факторов, имеющих функциональное значение для клетки, от незначимых. Энхансосомы как сами стимулируют вовлечение GTFs к промотору, так и GTFs облегчают сборку эихасосомы, что обеспечивает дополнительный уровень специфичности [133].
Примером энхансосомы служит комплекс, собирающийся на энхансере гена 3-интерферона человека. По крайней мере семь активаторов и коактиваторов совместно с хроматиновым белком HMGA кооперативно связываются с этим энхансером. Хроматиновый белок HMGA изгибает ДНК в районе энхансера и открывает таким образом сайты связывания. Рядом с энхансером также расположены сайты связывания активаторов, увеличивающие их локальную концентрацию [134].
Кооперативность - одна из причин, обуславливающих синергизм в регуляции транскрипции: регуляторний эффект набора факторов не равен сумме эффектов отдельных факторов. Синергизм в действии активаторов, как предполагается, объясняется двумя механизмами: во-первых, отдельные активаторы, взаимодействуя с различными мишенями, облегчают прохождение скорость-лимитирующих стадий при сборке РІС, во-вторых, различные активаторы в составе энхансосомы взаимодействуют с различными мишенями в аппарате общей транскрипции, обеспечивая их кооперативное вовлечение и сборку РІС. Так, для энхансера гена интерферона показано, что кофактор СВР кооперативно связывается с преформированной энхансосомой.
Действие большинства активаторов зависит от контекста и может изменяться в зависимости от того, какой белок связался рядом. Так, сайт связывания активатора Gal4 обнаружен более чем в 200 промоторах, в то время как in vivo связывание наблюдается только для 10 из них. Связывание фактора в данном случае, видимо, может контролироваться благодаря кооперативное либо путем формирования на хроматине недоступных для связывания структур [135]. Влияние контекста также обуславливает то, что один и тот же транскрипционный фактор может выступать в качестве активатора транскрипции в случае одного гена и в качестве репрессора транскрипции в случае другого гена.
Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд
Для того чтобы изолировать ген е(у)3 был использован метод для клонирования мутаций, вызванных встраиванием высококопийного мобильного элемента. Секвенировапие клонированного фрагмента показало, что вставка мобильного элемента Stalker произошла в локус CG12238, предположительно кодирующий белок размером около 2000 ак. Для подтверждения, что мутация е(у)3" действительно связана с локусом CG12238, соответствующая геномная область между сайтами ВатШ длиной 13481 Ьр, включающая ген и фланкирующие области, была проклонирована в вектор pCaSpeR-З. С помощью этой конструкции было получено 8 независимых трапсгеппых линий, содержащих вставку клонированной области в различные сайтах генома. Каждый трансген обладал способностью полностью комплементировать мутацию е(у)Зи1.
Локус CG12238 находится по цитологическим данным в районе 18D Х-хромосомы. Гибридизация с зондом на Stalker подтвердила наличие вставки мобильного элемента в данном районе. Таким образом было продемонстрирована тождественность гена е(у)3 и CG12238. Изучение структуры гена е(у)3 Для найденного локуса CG12238 предсказывается наличие гена, содержащего 11 кодирующих и 1 или 2 (в зависимости от используемого алгоритма) 5 -некодирующих экзона.
Для изучения структуры гена было получены несколько клонов кДНК гена е(у)3. Они были клонированы и секвенированы. Все они содержали одинаковую последовательность. Путем сравнения с последовательностью геномной ДНК показано, что ген состоит из 12 экзонов, значительно отличающихся по размеру, и занимает в геноме около 10,5 kbp. Имеется два больших интрона (рис. 2А).
Предполагаемая структура гена, описанная в базе данных, совпадает с обнаруженной. В полученном нами сиквепсе имеются следующие отличия от имеющегося в базе данных: - 6 дополнительных букв AGCAGC в 12 экзоне, - 2 молчащие замены в 4 и 12 экзонах, - 3 лишние буквы в 1 интроне, замена в 11 интроне. Первое отличие приводит к появлению двух дополнительных остатков S в полисериновом стретче на С-конце белка. Видимо, это - проявление полиморфизма.
Промотор для изученного транскрипта статистически является слабым. Имеется два потенциально более сильных альтернативных промотора: расположенный за 500 Ьр до обнаруженного и расположенный во втором экзоне (рис. 2А).
Геномная характерюация аллеля е(у)Зи1
Для изучения структуры мутации е(у)Зи место встраивания мобильного элемента было секвенировано. Оказалось, что Stalker встроился в начало 10 экзона в ориентации, противоположной ориентации гена (рис. 2А). Таким образом, была получена следующая картина: 5 -геномная ДНК Stalker З -конец CGATGAAAGCGACTTTAGCAG//TGTAATAGATGTAATAGATTTGCTTT Stalker 5 -конец 3 -геномная ДНК TTAGTCCAATATGCTACA//GCAGCACATCGAGCTGCAGCAGT Подчеркнут удвоенный в результате встраивания 4-нуклеотидный участок. Получение и характер изация новой мутации e(y)3EMSl
Для более детальной структурно-функциональной характеризации гена был получен другой аллель изучаемого гена - е(у)3ЕМ - путем обработки мутагеном этилметилсульфонатом (EMS). Эта мутация является летальной в гомозиготе у самок и гемизиготе у самцов, гибель происходит на эмбриональной стадии. Мутация е(у)3ЕМ не комплементирует мутацию е(у)Зи . Мутация е(у)3Е , как и е(у)Зи!, полностью комплементируется описанным выше трапсгеном-гепомной копией гена е(у)3.
Мутаген EMS модифицирует основания ДНК, что обычно приводит в результате действия системы репарации к заменам и делениям небольших участков ДНК [177]. Для выяснения молекулярных основ мутации методом PCR были получены фрагменты, перекрывающие кодирующую область гена (использовались гетерозиготы), затем эти фрагменты были секвенированы. В результате, помимо ряда молчащих замен, была обнаружена 11-нуклеотидиая делеция в 4 экзоне. Эта делеция приводит к сбою рамки считывания и появлению стоп-кодона через 15 Ьр после места делеции (рис. 2А, Б).
Картирование других мутаций гена е(у)3
В базе данных был обнаружен еще ряд мутаций, связанных с геном е(у)3. Эти мутации, полученые в широкомасштабном проекте по изучению функций генов дрозофилы [178], содержат вставку Р-элемента, Известные места встраиваний были прокартировапы (рис. 2В), Все эти мутации, кроме AJ426999, являются летальными на ранних стадиях развития (для указанной мутации сообщается стерильность самок). Имеются также мутации ЕРЮЗб, EY02011, KG01940 и PG143, относящиеся к гену е(у)3, но не охарактеризованные на молекулярном уровне.
Изучение структуры с помощью Нозерн-гибридизации
Нозерн-анализ ро1уА+-фракциии РНК взрослых мух показал наличие четырех транскриптов изучаемого гена размером от 10 kb до 6,5 kb, причем их относительное количество сильно отличается (рис. ЗА).
Для определения структуры транскриптов с низким разрешением они были картированы на наличие различных областей при помощи нозерн-гибридизации с зондами на соответствующие области (рис. ЗБ). Было обнаружено, что разнообразие транскриптов обусловлено наличием трех промоторов и двух сайтов полиадеиилирования в данном гене (рис. ЗВ).
Два длинных транскрипта несут протяженную З -нетранслируемую область. Эта область захватывает расположений рядом небольшой ген CG14212, ориентированный противоположно гену е(у)3. Этот ген предположительно кодирует фосфатазу. Указанная З -область содержит ряд последовательностей, схожих с AREs I класса (AUUUA рядом с U-богатыми последовательностями) - элементами З -некодирующией области РНК, служащих сигналом деградации мРНК [179].
Картирование с помощью RT-PCR
Для более детального изучения строения транскриптов был проведен RT-PCR с трех областей (Frl-З) кДНК изучаемого гена (рис. ЗВ). Были получены фрагменты, соответствующие по размеру имеющейся карте гена, и ряд меньших по размеру. Секвенирование показало, что последние являются артефактом PCR, а первые содержат все обнаруженные экзоны с теми же границами. Нам не удалось найти альтернативно сплайсированных форм РНК ни в виде наличия/отсутствия какого-либо экзона, пи в виде альтернативных акцепторых или доиориых сайтов.
Таким образом, была получена следующая картина: три длинных транскрипта имеют идентичную кодирующую часть (белок 2008 ак), а нижний кодирует белок, лишенный 163 N-концевых ак.