Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Изучение механизмов деструктивного действия УФ-излучения на клетки является актуальной задачей фотобиологии, в связи с существующей опасностью разрушения озонового слоя атмосферы и, как следствие, увеличения достигающего поверхности Земли потока УФ-излучения диапазона УФВ (280-320 нм), представляющего серьезную угрозу для'живых организмов [Сапежинский и Лозовская, 1993]. Высокочувствительной мишенью повреждающего действия излучения этого диапазона длин волн являются биологические мембраны. Основные компоненты мембран - белки и липиды легко повреждаются УФВ-светом: наблюдается нарушение функциональной активностимембранных белков [Konevctal., 1978] увеличивав пассивная проницаемость липидного бислоя [Владимиров и др., 1991]. В конечном итоге это приводит к нарушению ионного гомеостаза и лизису клеток [Рощупкин и др., 1988]. Одним из основных хромофоров, поглощающих УФВ-излучение в биологических мембранах является индольное кольцо триптофана. Роль триптофана в деструктивном действии УФ-излучения опредается продуктами его первичных фотохимических реакций. Природа этих фотопродуктовзавиегт от наличия в среде веществ, способных взаимодействовать с возбужденными молекулами триптофана [Greed 1984]. В этой связи большой интерес представляет изучение фотоники триптофана в присутствии различных техногенных загрязнителей окружающей гаеды, в частностиТ галогеноорганических соединений (ГОС). ГОСнаходят самое широкое применение в промышленности сельском хозяйстве, медицинеи в быту что приводит к их накоплению в окружающей среде, в организме человека и животных [Трошева и Сурнина 1998 Филов 1990]. Имеются данные о том что ГОС способны дсзак^овать синглстнос возбужденное состояние «.здольного хромофора [Chen et al 7996 Johansson 1997]. Вместе с тем, фотохимические реакции триптофана в присутствии ГОС, механизмы этих реакций и их роль в УФ-индуїфусмом повреждении мембран пока не изучены. Существующая опасность увеличения потока УФВ-света, достигающего поверхности Земли и рост загрязнения окружающей среды дотают задачу изучения модификации г^огеноТрганическими соединениями фотон. индольного хромофора актуальной.
Связь с крупными научными программами
Отдельные этапы данной работы выполнялись в рамках Республиканской программы "Функционирование биосистем" на 1989-1993 гг. - "Изучение механизмов фотоиндуцирусмых свободнорадикальных повреждений биологических мембран и клеток и разработка методов их протекции и усиления" (№ ГР 01890036812); Белорусского республиканского фонда фундаментальных иссле-даваний, грант МП94-49 (1995-1996 гг.) - "Модификация пшогсноорганиче-скими соединениями повреждений клеточных мембран индуцируемых УФ -светом экологического диапазона" (№ ГР 1996179).
Цель к задачн исследования
Цель настоящей работы - выяснить механизмы влияния пшогенооргани-ческих соединений па фотофизическис процессы и фотохимические реакции в индольном хромофоре и на индуцируемые УФ-излучениеы повреждения мембран.
Поставленная цель включала решение следующих задач:
I.Изучение влияния ГОС на фотопроцессы в триптофане и триптофан-содержащих белках.
2.Изучение влияния ГОС на индуцируемое УФ-излучением повреждение эритроцитарных мембранах.
З.Изученис фотосенсибилизирующей активности продуктов фоторазрушения триптофана, образуемых при облучении аминокислоты, белков и мембран в присутствии ГОС.
Объект и предмет псследовапия
В качестве объектов исследования использовались растворы триптофана, триптофан-содержащйх белков, суспензии изолированных эритроцитарныx мембран. :
Гипотеза
Предположено, что галогеноорганичсские соединения усиливают деструктавное действие УФ-излучения на мембраны, вследствие модификации фотофизических и фотохимических процессов в индольном хромофоре.
Методология и методы проведенного исследования
В работе использовались спектрофотометрический, флуоресцентный, полярографический, радиоизотопный и биохимические методы анализа.
Научная новизна и значимость полученных результатов
Изучено влияние ряда ГОС (хлороформа, четыреххлористого углерода, дихлорднфторметаиа, трихлорацетата натрия, хлорофоса) на индуцируемые УФ-излучением повреждения триптофана, триптофан-содсржащйх белков и зритроцитарных мембран. Показано, что в присутствии ГОС увеличивается кваптовый выход фоторазрушения триптофана в растворе и белковых трипто-фанилов, происходит образование новых фотохимических продуктов триптофана, увеличивается квантовый выход фотоинактивации фсрмс1ггов. Впервые показана интенсификация пшогснооргаиическими соедин1ниями перекисного фотоокисления липидов в мембранах. Установлено, что в основе влияния ГОС лежит фотоиндуцированное образование обладающих высокой окислительной активностью Тдикалов одноэлектронного восстановления ГОС, реализующееся с участиемвозбужденных состоянии триптофана а также фотосснсибили-зирующес действие фотохимических продуктов аминокислоты Одной из причин интенсификации перекиснем окиГения лишщов в мембранах при облучении УФ-излучашем в присутствии ГОС являете^ослабление антиока,-данг^ой зашить Sail связаннїТувеличспием ква.гтового выхода фотоде-^ции^ё^анногоот^ГффГа
Практическая значимость получепных результатов
Результаты исследования существенно расширяют и углубляют имеющиеся сведения о фотодеструктивных реакциях в биологических системах г.ри действии УФ-излучсния. Полученные данные могут быть использованы при оценке степени опасности увеличения фотоповреждений биологических систем в условиях возрастания фона УФ-излучсния н загрязнения окружающей среды тсхногенными ГОС.
Основные положения диссртации, выносимые на защиту
1.В присутствии ГОС (хлороформа, четыреххлористого углерода, дихлордифтормстана, ., ихлорацетата натрия, хлорофоса) увеличиваются квантовые выходы фотодеструкции триптофана в растворе и белковых триптофанилов, фотоинактивации ферментов, образуются новые фотохимические продукты триптофана, что свидетельствует о модификации фотофизических процессов и фотохимических реакций в индолыюм хромофоре.
2.В суспензии изолированных мембран эритроцитов в присутствии ГОС усиливается индуцируемое УФ-излучеиием перекисное окисления липидов. Эффект обусловлен фотоиидуцированным, с участием возбужденных состояний триптофанилов мембранных белков, образованием радикалов одноэлекгронно-го восстановления ГОС, а также увеличением квантового выхода фоторазрушення мембранного а1тиоксиданта а-токоферола.
З.Продукты фотохимической деструкции триптофана и белковых триптофанилов при облучении УФ-излу1ением с Х>300 нм генерируют сииглетнын кислород и могут выступать в качестве фотодинамическнТ сенсибилизаторов повреждений белков и мембран.
Личпый вклад соискателя
Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, анализ полученных данных и интерпретацня результатов проведены при решающем участии автора.
Апробация результатов диссертации
Результаты исследований апробированы на II1 конгрессе Европейского Общества Фотобиологов ( Будапешт, Венгрия, 1989г.), I съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 22-23 1юября 1994г.), II съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25-27 июня 1996г.), междуиароном конгрессе по радиационной защите (Вена, Австрия, 14-19 апреля І99бг), III съезде Белорусского общества фотобиологов и биофнзиков (Минск, Беларусь, 21-23 октября 1998г.), VIII конгрессе Европейского общества фотоб.юлогов (Гранада, Испания, 3-8 сентября 1999г.)
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 стагчЧ в научных журналах и сборниках, 7 тезисов докладов. Общее количество о..>оликованных страниц- 25.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из общей характеристики работы, введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов н методов исследования (1 глава),
изложения полученных результатов (3 главы), заключения и списка литературы, включающего 242 наименований. Работа изложена на 138 страницах, содержит 4 1 рисунок и 2 таблицы.