Микролимфодинамика в норме и патологии. Оптические методы исследования Галанжа, Екатерина Ивановна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Система лимфомикроциркуляции выполняет в организме разнообразные функции: обеспечивает поддержание состава и объема экстрацеллюлярпой жидкости, принимает участие в движении клеток, протеинов и воды из ткани и их возвращении в кровеносное русло, в гуморальной регуляции функций и т.д. (Куприянов В.В.и соавт, 1983; Ткаченко Б. И., 1984; Aukland K.et al.,1993). В настоящее время не вызывает сомнений, что нарушения лимфоциркуляции играют важную роль при развитии различных патологических состояний, таких как венозная недостаточность, инфекционные и сердечно-сосудистые заболевания, патология поджелудочной железы, воспалительные процессы различной этиологии, аномалии развития лимфатической и венозной систем и др. (Буянов В.М., 1990; Marcks Р., 1997; Kayikcioglu A. et al., 2000; Richard L. et al., 2000; Witte C.L. et al., 2000). Однако механизмы этих расстройств до сих пор во многом остаются неясными. В условиях патологии часто нарушается транспортная функция лимфатической системы. Это приводит к возникновению лимфатического отека (лимфедемы), который может появляться после хирургических манипуляций или рентгенотерапии опухолей, поражении лимфатической системы паразитами или бактериями (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. 1999; Marcks Р., 1997; Mortimer P.S., 1998; Richard L. et al., 2000). Так, вторичная лимфедема выявляется у 25-30% (по некоторым данным - до 80%) больных, оперированных по поводу рака молочной железы (постмастэк-томическая лимфедема) (Berlin Е. et al., 1999; Pain S.J. et al., 2000). Лечение лимфедемы до сих пор остается недостаточно эффективным (Marcks Р., 1997; Szuba A. et al., 1998). Требует дальнейшего изучения участие лимфомикроциркуляции в патогенезе ряда других острых и хронических патологических процессов, в том числе венозной недостаточности, никотиновой интоксикации и т.д.

Вместе с тем, функциональные исследования системы лимфомикроциркуляции в мире проводятся в небольшом числе лабораторий (Хугаева В.К., 1991, 1998; Benoit J.N. et al., 1989, 1991, 1997; Shirasawa Yu. et al., 2000). Несмотря на достигнутые успехи в изучении физиологии лимфатических микрососудов, многие вопросы пока остаются спорными и неясными. В частности, недостаточно выяснены законы перемещения жидкости по лимфатическим микрососудам. Насколько они отличаются от механизмов движения крови? Как соотносятся объемы лимфы, выбрасываемые в центральном и периферическом направлениях? Каковы физиологические механизмы регуляции лимфотока? Каков вклад внутренней лимфатической помпы (фазных сокращений, работы клапанов и т.д.) в регуляцию движения лимфы в отдельных лимфатических

ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИГ И'ОТЕКА С Пе.грбург MOgPK

микрососудах и как коррелируют параметры внутренней активности лимфан-гионов друг с другом?

Включение лимфатического звена в интегральные гомеостатические реакции обеспечивается сложной многоуровневой регуляцией и, в частности, местными регуляторными механизмами, обеспечивающими гибкое приспособление функции лимфатических микрососудов к потребностям конкретного региона ткани. Пока нет отчетливых представлений о характере изменений микролимфодинамики in vivo при изменении концентрации в тканях оксида азота (N0). До сих пор не изучено участие в регуляции микролимфодинамики (З_г и Зг-адренореактивных структур стенки микрососудов. Не исследована реакция системы лимфомикроциркуляции на действие ряда фармакологических и физических факторов. Так, хорошо известно положительное противоотечное терапевтическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) (Толстых П.И., Клебанов Г.И. и соавт., 2002; Zharov V.P. et al., 1999, 2000; Kaviani A. et al., 2003), но его эффекты на микролимфодинамику практически не изучены.

Для решения этих и других задач определяющее значение имеет выбор адекватного метода исследования. Существующие методы клинической лим-фодиагностики очень немногочисленны и не могут в полной мере охарактеризовать функциональное состояние лимфангионов. Прижизненное исследование микролимфодинамики в эксперименте является не простой задачей, что во многом обусловлено особенностями строения и функции лимфатических микрососудов. Лимфатические микрососуды прижизненно сложно визуализировать оптическими методами, поскольку они не окрашены, прозрачны и представляют собой слабо рассеивающие структуры. Количественный анализ лим-фотока затрудняется выраженным неламинарным осцилляторным характером движения лимфы. Использование простого и адекватного способа окрашивания микрососудов - введения красящих веществ в крупные коллекторы с целью окрашивания микрососудов - невозможно, поскольку, в отличие от кровеносной, лимфатическая система является незамкнутой. На сегодняшний день представляется перспективным совершенствование методов для исследования лимфомикроциркуляции, основанных на трансмиссионной микроскопии, а также разработка новых методических подходов, в том числе успешно применяемых для диагностики потоков в кровеносных микрососудах - доплеровских и спекл-корреляционных методов.

Целью настоящей работы является развитие и адаптация оптических методов исследования для количественного анализа микролимфодинамики в норме и патологии.

Задачи исследования.

1. Расширить возможности метода цифровой трансмиссионной витальной биомикроскопии для исследований микролимфодинамики.

2. Провести количественную оценку лимфотока с учетом его осцилляторного характера, фазных сокращений, функции клапанов и особенноеіей регуляции транспортной функции лимфангионов внутрилимфатическими факторами.

3. Проанализировать влияние стимуляторов и блокаторов продукции оксида азота и (3-адренорецепторов на функцию лимфатических микрососудов.

4. Изучить состояние микролимфодинамики при действии лекарственных и немедикаментозных факторов и оценить их эффективность в плане стимуляции транспортной функции лимфангионов.

5. Создать экспериментальные модели острых и хронических патологических процессов (острая и хроническая лимфедема, острая венозная недостаточность, никотиновая интоксикация) и оценить состояние лимфомик-роциркуляции при этих формах патологии.

6 Оценить возможности комбинированного использования различных модификаций спекл-корреляционных методов и цифровой трансмиссионной микроскопии для исследования микролимфодинамики.

7. Разработать алгоритм исследования микролимфодинамики in vivo

8. Оценить возможности применения оптического просветления тканей с помощью различных иммерсионных жидкостей с целью оптимизации исследования микроциркуляции.

Научная новизна. В работе показано, что применение метода цифровой трансмиссионной микроскопии и использование брыжейки крысы в качестве модельного объекта для исследования лимфатических микрососудов in vivo позволяют получить новую фундаментальную информацию о микролимфодина-мике в физиологических и патологических условиях. В результате: 1. Впервые в условиях in vivo измерены скоростные характеристики лимфотока с учетом возвратно-поступательного характера движения лимфы, а также определен ряд новых показателей фазного сокращения и работы клапана, оценены некоторые реологические свойства лимфы;

2. Установлены ранее неизвестные взаимосвязи между количественными параметрами фазных сокращений, работы клапана и количеством клеток в потоке лимфы и показателями скорости лимфотока;

3. Проанализирован характер и механизмы регуляции работы клапанов лимфатических микрососудов;

4. На основе детального анализа показателей микролимфодинамики определены параметры, имеющие первостепенное значение в стимуляции скорости движения лимфы в микрососудах;

5. Установлено участие оксида азота в регуляции лимфотока;

6. Доказано участие (3-адренореактивных систем в регуляции функции лимфатических микрососудов в физиологических условиях;

7. Разработана этиологически близкая к клинической ситуации модель острой и хронической лимфедемы, позволяющая, с одной стороны, измерить степень отека ткани; а с другой - количественно оценить функциональное состояние лимфатических микрососудов до и после формирования отека, и на основе этого выявить неизвестные звенья патогенеза лимфедемы;

8. Впервые установлены нарушения лимфомикроциркуляции при действии никотина;

9. Получена важная информация о патогенезе лимфомикроциркуляторных нарушений при острой венозной недостаточности, об ответах лимфатических микрососудов на фармакологические (диметилсульфоксид) и немедикаментозные лечебные воздействия (низко- и высокоинтенсивное лазерное излучение);

10. Доказано, что комбинация цифровой трансмиссионной микроскопии с различными модификациями сиекл-корреляционного метода имеет достоверные преимущества для исследования микролимфодинамики in vivo по сравнению с существующими ранее техническими подходами и позволяет, сохранив все достоинства каждого из методов, устранить их основные недостатки;

11. Установлено, что действие различных иммерсионных жидкостей на оптические свойства ткани и состояние микроциркуляции при одинаковой направленности эффектов имеет специфические особенности (степень изменения показателя отражения кожи, длительность эффекта просветления, продолжительность стазов в микрососудах и т.д.).

Практическая значимость. В процессе исследовательской работы были расширены возможности трансмиссионной микроскопии, а также разработана и адаптирована для функционального исследования лимфомикроциркуляции

комбинация микроскопического метода и различных модификаций спекл-корреляционных методов. Все методические подходы к исследованию микролимфодинамики были успешно внедрены в экспериментальную рабоїу. Предложенный алгоритм исследования лимфатических микрососудов позволяет проводить быструю и наиболее полную на сегодняшний день оценку комплекса параметров микролимфодинамики в норме, патологии, а также в динамике того или иного воздействия.

Установленные механизмы нарушений функции лимфангионов при патологических состояниях являются научной основой, позволяющей обозначить главную стратегию лечения, оптимизировать комплекс лечебных мероприятий и предложить новые патогенетически обоснованные терапевтические программы стимуляции механизмов активного транспорта лимфы.

Связь с государственными и международными программами. Исследования по теме диссертации соискателем выполнялись частично в рамках совместных международных программ: в научно-исследовательской лаборатории под руководством проф. Жарова В.П. (University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock, USA), в научно-исследовательской лаборатории под руководством проф. R.K. Wang (Institute of Bioscience and Technology of Cranfield University, UK), в научно-исследовательской лаборатории под руководством проф Q. I.uo (Institute for Biomedical Photonics, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China). Исследования были частично осуществлены при поддержке научных грантов «Создание научно-образовательного центра «Нелинейная динамика и биофизика» (CRDF и Министерства образования РФ № REC-006), РФФИ №98-02-17997 и №99-15-96040, Президента РФ «Оптика и спектроскопия рассеивающей и многокомпонентной среды: биофизическая и медицинская диагностика, фотобиология и фотомедицина» («Поддержка ведущих научных школ» № 00-15-96667 и № 25.2003.2), Ведущих научно-образовательных коллективов РФ № 2.11.03 Министерства Образования РФ, CRDF №№ TGP-642 и TGP-891, «Развитие когерентно-оптических методов для мониторинга реологии крови» («Royal Society») и Федеральной научно-технической программы «Биофотоника».

Достоверность результатов диссертации. Достоверность полученных результатов и выводов обеспечивается адекватностью используемых методов и объектов исследования, использованием современных апробированных методов измерений и статистической обработки экспериментальных данных Достоверность оригинальных экспериментальных результатов подтверждайся

воспроизводимостью результатов экспериментов, а также данными статистического анализа.

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научных конференциях и симпозиумах: на 6-м международном конгрессе «World Congress for Microcirculation» (Munich, Germany, 1996); на 9-й международной конференции «Vascular Biology Meeting» (Seattle, USA, 1996); на международных конференциях «SFM, Workshop on Optical Technologies in Biophysics and Medicine» (Саратов, Россия, 1998_:2003); на международных симпозиумах «Biomedical Optics, BiOS» (San-Jose, С A, USA, 1998-2003); на II Интернациональном симпозиуме "Tissue monitoring and 3D-lmaging of diseased Organs" (Erlangen, Germany, 2000); на международной конференции «European Biomedical Optics Week, EBiOS, SPIE » (Amsterdam, Netherlands, 2000); на международных конференциях «European Conference on Biomedical Optics, OS A, SPIE » (Munich, Germany 2001, 2003); на международной конференции «International Workshop on Biophotonics - SIWB-02» (Саратов, Россия, 2002); на международной конференции «Conference on Lasers, Applications and Technologies, IQEC/LAT » (Москва, Россия, 2002); на 22-м заседании «European Society for Microcirculation» (Exeter, UK, 2002); на 5-й международной конференции «Lymphedema Network International Conference» (Chicago, USA, 2002), CLEO-03 (Baltimore, USA, 2003).

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Использование цифровой трансмиссионной микроскопии позволяет проводить детальный анализ микролимфодинамики in vivo в остром и хроническом эксперименте.

2. Наиболее эффективная интенсификация лимфотока в интактных микрососудах может быть достигнута за счет стимуляции спонтанных фазных сокращений и работы клапана.

3 Важным фактором, запускающим работу клапана, является изменение латерального натяжения сосудистой стенки.

4. При оценке эффективности лимфодренажной функции микрососудов необходимо учитывать осцилляторный характер движения лимфы и определять соотношение объема лимфы, выбрасываемого в центрипетальном направлении, к объему ретроградного заброса за единицу времени.

5. Применение комбинированной техники, включающей метод цифровой трансмиссионной микроскопии и спекл-корреляционный метод, повышает

')

объективность и информативность комплексного исследования микро-лимфодинамики.

6. Оксид азота и Р-адренореактивные структуры принимают участие в регуляции лимфотока.

7. Разработанные экспериментальные модели острой и хронической лимфе-демы и острой венозной недостаточности позволяют исследовать нарушения микролимфодинамики на разных стадиях развития отека.

8. Функциональное состояние лимфангионов существенно изменяется при низкоинтенсивном лазерном воздействии, местном применении ДМСО, действии никотина и деструкции кровеносных сосудов с помощью импульсного лазера.

9. При оптическом просветлении тканей с целью повышения эффективности оптической томографии, фотодинамической терапии, фотодеструкции микрососудов и других глубинных структур иммерсионное просветляющее действие зависит от свойств осмотически активного агента.

Публикации. По теме диссертации опубликовано свыше 60 научных работ, в числе которых глава в коллективной монографии, 12 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, статьи в тематических сборниках и трудах научных конференций.

Личный вклад соискателя. Личный вклад соискателя состоит в постановке основных задач диссертационною исследования, обосновании методов их решения, выборе объектов экспериментального исследования и экспериментальных методик, проведении экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Представленный в работе алгоритм исследования микролимфодинамики, а также экспериментальные модели лимфедемы и венозной недостаточности разработаны автором самостоятельно. Разработка экспериментального оборудования выполнена совместно с доктором физико-математических наук, профессором Ульяновым С.С. и кандидатом физико-математических наук Федосовым И.В. На выбор направления научных исследований оказали существенное влияние научные идеи доктора медицинских наук, профессора Григория Ефимовича Брилля, докторов физико-математических наук, профессоров Валерия Викторовича Тучина и Владимира Павловича Жарова.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 306 страницах машинописного текста и состоит из введения, основной части, содержащей 8 глав,

заключения и списка использованной литературы. Указатель цитируемой литературы включает 473 источников, в том числе 60 ссылок на публикации автора по теме диссертации. Работа содержит 12 таблиц и иллюстрирована 87 рисунками.