Введение к работе
Актуальность ігооблеки. Термодинамические исследования б"оцолимеров являются относительно новым и взыщи направлением современной молекулярной биологии. Равновесная терыодина-мика я мякрокалоримегряя ьизволяют получить данные дан расчета энтальпии, энтропии и энергии Гиббса процессов образования макромолекул, их равновесных конформацаонных перестроек, а такг.е явлений связывания лигакдов с участием этих молекул. 3 первую очередь это интересно для тех, кто имеет дело с внутримолекулярными кооперативными трансформациям;; биополимеров, стабильностью их пространственных отруїли, внутримолекулярным взаимодействием с растворителем и малыми молекулами, которые во многом определяют структуру и структурные трансформации биополимеров в растворе.
Важной областью термодинамических исследований является изучение свойств ДНК в растворе как в присутствии, так и в отсутствии взаимодействующих с биополимером ионов металлов и малых молекул. Изучение состояния ДНК в бессолевых растворах в отсутствии противоионов тлеет большое биологическое значение, так как показано, что в клеточном ядре во. ;дствие высокой концентрации ДНК отношение числа фосфатных групп и низкомолекулярных катионов почти такое же, как и в бессолевых' растворах ДНК. Такое концентрированное бессолевое состояние ДНК исследовано крайне мало и только в последнее время стало интенсивно изучаться. Не менее интересной областью термодинамических' исследований ДНК является изучение взаимодействия ДНК с такими лигавдами как ионы металлов,- интеркалирулцие красители,-антибиотики, малые белки и другие. Хорошо известно, что ионы металлов необходимы для поддержания нативного состояния ДНК в живой клетке, а также являются фактором, необходимым для сохранения целостности многих других биологических структур. Многие малые молекулы способны влиять на структуру и биологг -ческие функции нуклеиновых кислот, в первую очередь на процессы передачи генетической информации. Широко известна роль малых молекул в процессах мутагенеза и канцерогенеза, а также их возможности выступать в качестве химиотерапевтическихи противоопухолевых средств.
Несмотря на то, что проблема взаимодействия малых молекул с ДКК привлекает к себе большее внимание, конкретные места связывания многих из малых молекул с ДНК, взаимодействие их
с определенным типом азотистых оснований и/или нуклеотидными последовательностями, влияние их на локальную конформацию, кооперативные конформационные переходы и термодинамические свойства ДНК в растворе во многих случаях остаются неясными. В саязис этим микрокалориметрическое исследование термодинамических свойств ДНК в аироксм диапазоне концентраций одно-и двухвалентных катионов (включая бессолевые растворы), интер-калирующих красителей, противоопухолевого антибиотика актино-мицина Д и гиетэна HI представляется актуальным.
Работа выполнена в рамках теки: "Изучить механизм самосборки хроматина, используя термодинамические параметры кооперативных переходов ДНК и гистоновых ассоциатов к их комплексов с биологически активными зєществами", зходящей в республиканскую программу фундаментальных исследований для медицины.
Цель работы. Целью данной работы являлось микрокалориметрическое исследование термодинамических свойств ДНК в широком диапазоне кэнцентрагчй одно-и двухвалентных катионов (включая бессолевые растворы), интеркалирующих красителей, противоопухолевого антибиотик актикомицина Д и гистона HI.
Научная новизна работы. В работе впервые проведено микрокалориметрическое исследование концентрированных бессолевых растворов ДНК из тимуса теленка и определены термодинамические параметры денатурации ДНК в этих растворах. Обнаружена линейная зависимость температуры плавления тимусной ДНК в бессолевых растворах в очень широком диапазоне концентраций биополимера к сделан вывод о сходстве механизмов стабилизации ДНК в бессолевых и содержащих поддерживающий электролит раст-* ворах. Впервые показано, что линейная зависимость энтальпии . денатурации (ЛНдд) от температуры плавления (Тпл) ДНК в растворах HaCl непосредственно связана с величиной разности теплоемкости нативного и денатурированного состояния ДНК (ЛС). Обнаружено, что величина скачка теплоемкости при денатурации ДНК; оцтделенная непосредственно на кривой плавления, в пределах ошибки измерений совпадает со значением." CL, определенным из зависимости АН^ от 1nJi ДНК. Полученные термодинамические данные доказывают, что механизм стабилизации ДНК одно-одковалентными электролитами имеет энтропийную природу и представляют интерес для развития существующих теорий сильнозаряженных шлиэлектролитов типа ДНК.
Методом микрокалориметрии впервые изучена тепловая дена-
турацкя ДЯК в широком диапазоне концентраций ионов магния и кальция при физиологической концентрации WaCi . Показано, что термостабильнос.ь ДНК увеличивается при низких концентрациях катионов, а при высоких - уменьшается. Обнаружено ; wro при средних и высоких концентрациях магния и кальция ьосле частичкой денатурации ДНК образуется агрегированная (компактная) форма ДНК, которая кооперативно разрушается при значительно более высоких температурах.
Впервые проведено микрокалориметрическое исследование тепловой денатурации ДНК в присутствии интеркалирующих красителей (этидиум бромид, акридин оранжегчй) и противоопухолевого антибиотика актиномкцина Д. Показано, что эти значительно стабилизирующие ДНК соединения преимущественно взаимодействуют с последовательностями ДНК, обогащенными гуанин-цитозиновыми парами оснований, причем очень высокую специфичность к определенным последовательностям ДНК проявляет актиномицин Д.
В работе разработан метод фракционирования ДНК по ГЦ-сос-таву гистоном KI и проведена оценка степени фракционирования с помощью сканирующей микрокалориметрии.
Вышеупомянутые результаты, а также рр^аботанные в диссертации методы исследования ДНК выносятся на защиту.
Апробация аботы и публикации. Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме по биокалориметрии (Тбилиси, 1981), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Меадународном симпозиуме по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетке (Пущино, 1985), Всесоюзном симпозиуме по информационным изменениям биголимеров в растворе (Тбилиси, 1985). Основные результаты работы опубликованы в 14 печатных работах.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, глав литературного обзора, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы ( 165 наименований). Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 13 таблиц.