Введение к работе
Актуальность проблемы. В результате многочисленных работ
сложились представления об уникальной роли регуляторных
механизмов, обеспечивающих стационарность процессов
пероксидного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран. Показано, что защита от окисления мембранных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), являющихся основным субстратом окисления (McCay et al., 1971), осуществляется с участием ферментативной системы (Fridovich, 1974-1979, Chance et al.1979, Flohe, 1982) и относительно низкомолекулярных биоантиоксидантов, выполняющих роль ловушек свободных радикалов (Кудряшов, 1964, Эмануэль, Бурлакова, Храпова, 1964, Tappel, 1968). Развитие данного направления в 70-90 годы позволило получить доказательства, что нарушение регуляции ПОЛ можно рассматривать в качестве неспецифического патогенетического маркера целого ряда заболеваний. Перспективы, обусловленные возможностью коррекции ПОЛ, вызвали повышенный интерес к проблеме биоантиоксидантов. Было установлено, что систему неферментативной антиоксидантной защиты составляют токоферолы (ТФ) (Tappel, 1970, Аристархова, Бурлакова Храпова, 1972, Ingold, 1982), убихиноны или коэнзим Q) (Наумов, Храпова, 1984), филлохинон (витамин Kj) (Бурлакова, 1975), которые существуют в фенольной и хинонной форме, а также р- каротин, его аналоги (Касаикина, Гагарина, Эмануэль, 1975, Burton, Ingold, 1984, Krinski, 1989, Terao, 1989) и витамин А (Конь, Горгошидзе, 1987). При этом было показано, что антиоксидантная и биологическая роль данных веществ взаимосвязаны. Дискуссионным остается механизм воздействия природных ингибиторов на интенсивность ПОЛ биомембран. Известно мнение, что влияние биоантиоксидантов осуществляется за счет изменения активности антиоксидантних ферментных систем (Ланкин, 1986), другие исследователи, не исключая возможностей опосредованного участия, рассматривают все же в качестве ключевой способность прямого взаимодействия антиоксидантов (АО) с пероксильными радикалами, ведущими процесс неферментативного окисления (Бурлакова, 1984-1994). Было показано, что природным АО, в частности а-ТФ как основному липидному АО, присуще чрезвычайно высокое сродство к пероксильным радикалам (Бурлакова, Храпова, 1972, Burton, Ingold, 1981), причем активность фенольных форм в 1000 раз выше по сравнению с хинонной формой (Бурлакова, 1975, Наумов, Храпова, 1984) .Для высоких концентраций а-ТФ обнаружено прооксидантное действие (Аристархова, Бурлакова, Храпова, 1972, Кухтина, 1982),
которое, по всей вероятности, связано с его способностью
образовывать достаточно активные феноксильные радикалы,
участвующие в реакциях продолжения цепей. К началу настоящей
работы не были получены прямые экспериментальные данные о
значимости данной реакции в кинетике окисления. Между тем
знание механизма действия АО является залогом надежности
критериев скрининга высокоэффективных ингибиторов среди
веществ природного происхождения, отбора среди
модифицированных структур биоантиоксидантов и их
синтетических аналогов. Важно иметь представления о возможности
взаимодействия АО в составе сложных смесей. Следует отметить,
что система природных АО до настоящего времени воспринимается
как совокупность взаимонезависимых компонентов биомембран,
однонаправленно воздействующих на окисление фосфолипидов
(ФЛ), которые рассматриваются большинством исследователей
исключительно как субстрат пероксидации. К началу данной работы
не был изучен характер взаимосвязей между важнейшими
составляющими липидов биомембран, отмечались лишь первые шаги
на пути выявления возможностей межмолекулярных
взаимодействий компонентов в сложной природной системе. Между тем исследование кинетики и механизма взаимоотношений между индивидуальными биоантиоксидантами, а также ингибиторами и ФЛ весьма актуально, поскольку позволяет вскрыть новые элементы первичных механизмов регуляции ПОЛ, обеспечивающих антиоксидантный гомеостаз организма, и может послужить теоретической основой прогнозирования результатов направленных модификаций состава липидов биологических мембран.
Целью настоящей работы являлось установление общих
кинетических закономерностей окисления многокомпонентных
липидных систем возрастающей сложности, выяснение системного
характера взаимосвязей между индивидуальными составляющими
липидов природного происхождения, обоснование модели
организации и механизмов взаимодействия звеньев
неферментативной системы защиты липидов от окисления.
Задачи исследования. В работе были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать особенности кинетики и механизма
неферментативного окисления модельных липидов,
межмолекулярные взаимодействия и механизм образования связей в системах, содержащих а-ТФ, хиноны или каротиноиды.
-
Установить возможность образования комплексов между молекулами ос-ТФ и ФЛ, определить константы и энтальпии образования связей.
-
Исследовать закономерности окисления природных липидных систем, включающих биоантиоксиданты и ФЛ различного строения и установить роль различных фрагментов молекулы ФЛ в действии их как синергистов ингибиторов окисления.
-
Количественно оценить константы элементарных реакций взаимодействия феноксильных радикалов а-ТФ и его аналога хромана С; с субстратами разной степени ненасыщенности и ФЛ различного строения и состава.
-
Получить химическую и кинетическую информацию о путях превращений ФЛ в ходе окислительного процесса. Изучить кинетику накопления гидропероксидов и расходования а-ТФ в присутствии ФЛ.
-
Изучить ингибирующую способность группы новых АО ряда модифицированных нафтохинонов и показать возможности увеличения их эффективности в сочетании с ФЛ. Разработать новые способы стабилизации окисления полиенов и высоконенасыщенных липидов природного происхождения.
Научная новизна. В диссертационной работе впервые
показаны и систематически изучены эффекты синергизма в
совместном антиоксидантном действии природных и синтетических
хинонов с ФЛ различного строения, установлена взаимосвязь
состава ФЛ и их эффективности как синергистов в смеси с а-ТФ,
хроманом Сі, кверцетином, дибунолом, фенозан-кислотой, показана
роль различных фрагментов химической структуры ФЛ в
проявлении ими синергической активности. Показаны эффекты
синергизма а-ТФ с азотистыми основаниями (этаноламином и
ацетилхолином). Установлено, что ингибирующая способность а-ТФ
в присутствии ФХ или азотистых оснований в зависимости от
условий окисления может возрастать на 10-350%. Получены
экспериментальные подтверждения возможности элиминирования
азотистого основания в процессе окислительных превращений ФЛ.
Определены константы скорости реакции (10) взаимодействия
феноксильных радикалов а-ТФ с соевым и яичным (ФХ),соевым
фосфатидилэтаноамином (ФЭА), кардиолипином (КЛ)(из бычьего
сердца). Найдены абсолютные значения Кю при взаимодействии
2,2,5,7,8-пентаметил-6-гидроксихромана (хромана Сі) с
метилолеатом (МО), метиллинолеатом, аллоцименом, арахидоновой кислотой и соевым ФХ. Установлена возможность восстановления
феноксильных радикалов а-ТФ при их взаимодействии с арахидоновой кислотой (20:4) и яичным ФЭА. Впервые показаны эффекты антагонизма между важнейшими природными АО липидов: а-ТФ и убихиноном (коэнзимом Q), филлохиноном (витамином Кі), менадионом, а-токоферилхиноном, а-токотриенолом, Р-каротином и ретинола пальмитатом (витамином А). Обоснован и экспериментально подтвержден механизм образования комплексов с межмолекулярной водородной связью в системах, содержащих а-ТФ и природные хиноны. Установлен механизм взаимодействия а-ТФ с продуктами превращения (3-каротина, обосновывающий впервые выявленный антагонизм в совместном действии данных АО.
Изучены закономерности эффекта синергизма ФЛ с группой синтетических аналогов менадиона и N-производными 2-метил-З-ариламинометил-1,4-нафтохинона.
Впервые показано, что антиоксидантная активность природных липидов на (60-70)% обусловлена эффектом синергизма биоантиоксидантов и ФЛ.
Разработан новый способ стабилизации окисления эфиров
ПНЖК и высоконенасыщенных природных липидов,
заключающийся в использовании смеси а-ТФ, бензафлавина, яичного ФХ Найден новый источник биологически активных липидов, содержащих высшие жирные кислоты семейства "омега-3", показана перспективность их использования в качестве натуропатического продукта и основы лечебно-косметических средств: крема, геля. Научно-практическая значимость результатов работы
Результаты настоящей работы позволили установить характер системных взаимосвязей между важнейшими компонентами липидов, а также выявить роль и возможность реализации эффектов антагонизма в совместном действии природных АО (а-ТФ и хинонов, а-ТФ и (3-карогина или витамина А), роль эффектов синергизма в системах, содержащих биоантиоксиданты и и ФЛ, что создало основу для понимания не известных ранее первичных механизмов регуляции ПОЛ. Полученные данные дают возможность прогнозировать последствия применения исследуемых веществ с целью направленных модификаций антиоксидантного статуса организма.
Кинетическая и химическая информация представляет научную основу обоснованного применения смесей двух природных АО, и их композиций с ФЛ с целью эффективной стабилизации
пищевых липидов и фармпрепаратов применительно к конкретным условиям и субстратам окисления.
Результаты работы могут служить теоретическим обоснованием химического синтеза нового класса биологически активных веществ- потенциальных мембранопротекторов.
Исследованы новые высокоэффективные антиоксиданты класса N-производных 2-мегил-3-ариламинометил-1,4-нафтохинона и показаны пути увеличения их эффективности.
Разработан новый способ, позволяющий увеличить в (1,3-2,0) раза продолжительность ингибирования полиенов и природных высоконенасыщенных липидов (Патент 95102928, дата поступления 28.02.1995 приоритет от 9.03. 1995г.)
Разработан способ извлечения (Патент. 95103108, дата поступления 28.02.1995 г. приоритет от 16.03. 1995г.), подробно изучен состав, химико-токсикологические характеристики натурального рыбного жира сиговых, лососевых и осетровых рыб Обского бассейна, внедренного в качестве лечебно-профилактического продукта: масла (ТУ 9281-004-34458166-95) и капсул ( ТУ 9281-005-34458166-95), рекомендованных при гиперхолестеринемии, ишемической болезни, атеросклерозе, в качестве основы лечебно-косметических средств (ТУ 9151-003-34458166-95).
Разработаны (Патент 95105026, дата поступления 3.04.1995, приоритет от 12.04.1995.) и внедрены новые лечебно-косметические препараты на основе полиненасыщенных природных липидов сиговых рыб: лечебно-косметический крем (ТУ 9158-002-34458166-95) и лечебно-косметический гель (ТУ 9158-001-34458166-95).
Предложена модификация конструкции прибора для изучения процессов окисления и дыхания (рационализаторское предложение N 277 Тюменского медицинского института (ТМИ) от 15.11.1980 г.), использованная в собственных экспериментах, а также на ряде кафедр ТМА, Тюменском филиале института кардиологии.
Отдельные разделы работы включены в учебный спецкурс"Биофизические механизмы регулирования интенсивности пероксидации липидов", читаемый студентам врачебного факультета ТМА, использованы в "Руководстве по гиперхолестеринемии", подготовленном для студентов врачебного факультета, вошли в пособие "Липидные лекарственные препараты", написанное автором для студентов фармацевтического факультета.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 1 - 4 Всесоюзных совещаниях "Биоантиоксидант" (Москва, 1983, 1986, 1989, 1992), Всесоюзном совещании "комплексные гигиенические исследования здоровья жителей
Сибири",Новокузнецк,1981,Всесоюзной конференции", Всесоюзном совещании "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", Ташкент, 1986, Всесоюзном совещании по хемилюминесценции, Рига, 1990, Всесоюзной школе-семинаре по био-термо-хемилюминесценции, Суздаль, 1990, Международном симпозиуме по биохимии липидов, Санкт Петербург, 1994, Международном симпозиуме по хронобиологии, Тюмень, 1982, 2 и 3 Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1995, 1996, 1 и 2 Международных симпозиумах "Питание и здоровье: биологически активные добавки к пище", Тюмень, 1995, Москва, 1996, 2 Международном симпозиуме по окислению, Казань, 1995, 2 международной конференции "Проблемы охраны здоровья и социальные аспекты освоения газовых и нефтяных месторождений в Арктических регионах", 12 областных конференциях по актульным проблемам химии, биологии и медицины,Тюмень, 1980- 1985, 1988-1994, 4 зональных конференциях "Патология и антиоксидангты", Тюмень, 1987, Свердловск, 1989, 1990, 1992.
Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 39 работах (20 статьях и 19 тезисах докладов), получены 3 патента.
Краткая характеристика объектов и методов исследования.
Объектами исследования служили АО: а-ТФ, убихинон, (Serva, Германия), филлохинон (витамин Kj), синтезированный в химической академии им. М.В. Ломоносова, (3-каротин, витамин А (ретинола пальмитат), синтезированные в НПО "Витамины", а-токоферилхинон, а-токотриенол, а также кверцетин, менадион (Sigma, США). Использовали синтетические ингибиторы: дибунол, фенозан-кислота синтезированные в ИХФ РАН, группа N-производных 2-метил-3-ариламинометил-1,4-нафтохинона, условно названные как автокомплексы (АК): АК-40, АК-49, АК-135, АК-174, синтезированные в Латвийском государственном университете.
Изучали ФЛ различного строения: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, кардиолипин, сфингомиелин (Serva, Германия), а также соединения, моделирующие отдельные фрагменты их химической структуры: этаноламин, ацетилхолин, 1,2-диацетилглицерофосфат натрия (Ferak, Германия).
В качестве субстратов окисления использовали метилолеат и метиллинолеат Львовского химфармзавода, дважды перегнанные под вакуумом при остаточном давлении 5-10 мм рт. ст. Применяли смесь этиловых эфиров ПНЖК микробиологического происхождения ("биен") содержащий до 30% арахидоновой кислоты, полученный с
экспериментального производства объединения "Белмедпрепараты",
г. Минска. Были использованы также линолевая, арахидоновая
кислоты, аллоцимен (8:3) (Serva, Германия). Липиды выделяли из
органов и тканей рыбы Coregonus peled (Gmelin) (белые и красные
мышцы, печень, мозг, икра, внутренние жировые ткани, целая
тушка). Экстракцию липидов проводили по методу (Bligh, Dyer,
1959). Общие липиды разделяли на нейтральные и ФЛ по методу
Кейтса, 1975. Количественный и качественный анализ состава
липидов проводили методом ТСХ. Анализ ФЛ осуществляли по
методу Светашева и Ваеыдавского, 1973. Анализ состава жирных
кислот проводили методом ГЖХ на хроматографе Chrom-5 (Чехия)
с применением пламенно-ионизационного детектора. МЭЖК
получали по методу (Reichvald et al., 1973). Содержание ТФ
определяли по методу (Emmerie, Engel, 1938). Содержание
убихинона и убихроменола устанавливали методом Донченко и др.,
1979). Спектры поглощения и кинетику гибели токоферокешюв
регистрировали методом импульсного фотолиза (Кузмин и др., 1976).
Для изучения антирадикальной активности липидов
использовали хемилюминесцентный метод (Шляпинтох и др., 1965),
по методике (Храпова, Бурлакова, 1972). Изучали кинетику
поглощения кислорода (Цепалов, Шляпинтох, 1959) в манометрических в установках типа Варбурга. Положения, выносимые на защиту:
1. Антирадикальная активность и количественные соотношения
компонентов в системе АО липидов природного происхождения.
2. Проявление эффектов синергизма в совместном ингибирующем
действии природных АО и ФЛ.
3. Образование комплексов между молекулами а-ТФ и ФЛ.
4. Возможность проявления эффекта антагонизма АО в процессе
окисления, ингибируемого смесями а-ТФ и (3-каротина или
витамина А, а-ТФ и хинонов (убихинона, витамина Kj, се-
токотриенолхинона, менадиона).
5. Кинетика и константы скорости реакции феноксильных радикалов
а-ТФ с высшими жирными кислотами разной степени
ненасышенности и ФЛ. Возможность регенерации а-ТФ при
взаимодействии с субстратом.
6. Особенности состава нового источника липидов, содержащих
высшие жирные кислоты семейства "омега-3" и способ увеличения
их устойчивости к окислению.