Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор . 6
II. 1. Организация вкусового анализатора. 6
И.2. Трансдукция вкусового сигнала. 8
И.З. Первичные мессенджеры вкусовой почки . 14
ІІ.4. Основные внутриклеточные сигнальные молекулы. Интерференция ІРз/Ca и сАМР каскадов. 18
И.5. Кальций - классический вторичный мессенджер . 21
ІІ.6. Выброс АТР. 30
III. Экспериментальная часть . 32
Ш.1. Материалы и методы. 32
III. 1.1. Выделение изолированных вкусовых почек. 32
III. 1.2. Метод микрофотометрии и экспериментальная установка . 33
III. 1.3. Измерения внутриклеточного сАМР. 36
III. 1.4. Культура клеток. 36
Ш.2. Результаты и обсуждение. 37
Ш.2.1 Ответы вкусовых клеток на АТР и другие нуклеотиды. 37
Ш.2.2. G-белки, вовлеченные в трансдукцию АТР. 43
Ш.2.3. Вклад различных изоформ фосфолипазы С. 47
Ш.2.4. сАМР-зависимая регуляция чувствительности вкусовых клеток к внеклеточному АТР . 53
Ш.2.5. Выброс АТР вкусовыми клетками. Визуализация с помощью биосенсоров. 57
Ш.2.5.а.АТР-биосенсор. 58
Ш.2.5.б. Выброс АТР вкусовыми клетками. 63
IV. Заключение. 68
V. Выводы. 70
VI. Список литературы.
- Первичные мессенджеры вкусовой почки
- Кальций - классический вторичный мессенджер
- Метод микрофотометрии и экспериментальная установка
- сАМР-зависимая регуляция чувствительности вкусовых клеток к внеклеточному АТР
Введение к работе
Вкус наряду со зрением, осязанием, слухом и обонянием является одним из пяти основных чувств, участвующих в восприятии информации об окружающем нас мире. Основной функцией вкусовой системы является оценка качества пищи, проверка ее съедобности. Так, в ходе эволюции млекопитающими была развита высокая чувствительность к горькому, так как большинство горьких веществ являются ядовитыми, с другой стороны, имеющие привлекательный (т.е., сладкий) вкус вещества являются высококалорийными. Считается, что человек способен различать пять базовых вкусов: кислый, соленый, сладкий, горький и умами (шпаті), который вызывается глютаматом и некоторыми другими аминокислотами. Поведенческие эксперименты, а также регистрации активности вкусовых нервных волокон свидетельствуют о том, что вкусовой анализатор животных так же способен различать эти базовые вкусовые модальности. Это предполагает существование специфических молекулярных структур на рецептирующей поверхности вкусовых клеток, которые отвечают за отдельное распознавание каждого вкусового стимула. Исследования вкусовой системы методами молекулярной биологии подтверждают, что это действительно так. В частности, в последние годы идентифицированы мембранные рецепторы для сладких и горьких веществ и аминокислот, вызывающих умами (umami) вкус. Тем не менее, молекулярные механизмы вкуса во многом не ясны, поскольку во вкусовой клетке ни для одного из вкусовых стимулов не прослежена вся последовательность событий от взаимодействия с молекулярным рецептором до выброса нейромедиатора.
Одной из задач физиологии вкусового органа, которую предстоит решить, является исследование межклеточных коммуникаций во вкусовой почке. Популяция вкусовых клеток гетерогенна. Во вкусовой почке идентифицировано три морфологически различных типа веретенообразных клеток, функциональная роль которых доподлинно неизвестна, но которые, по-видимому, выполняют рецепторную, поддерживающую и/или секреторную функции. Эти клетки обмениваются примерно раз в двадцать дней, развиваясь из клеток предшественников и в конце жизни подвергаясь апоптозу. Поскольку вкусовые клетки устанавливают афферентные синапсы с вкусовыми нервами, то их непрерывное обновление требует постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке. Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация также может подвергается первичной обработке во вкусовой почке. Протекание всех этих гетерогенных, но синхронизированных процессов, несомненно, требует хорошо отлаженных коммуникаций между клетками вкусовой почки."Ряд фактов, установленных в последние годы, свидетельствуют в пользу подобной точки зрения. В частности, присутствие сигнальных молекул нескольких типов (серотонин, ацетилхолин, ГАМК, субстанция Р) во вкусовой почке было показано иммуногистохимически, в то время как присутствие во вкусовых клетках рецепторов к ним было показано методами молекулярной биологии и электрофизиологии.
Недавно в нашей лаборатории было установлено, что вкусовые клетки желобоватого и листовидного сосочков экспрессируют метаботропные P2Y рецепторы, активация которых приводит к мобилизации внутриклеточного Са . Фармакологическое исследование Са ответов вкусовых клеток показало участие P2Y2 и P2Y4 рецепторов, которые, скорее всего, играют основную роль в рецепции на экстраклеточных нуклеотидов. Эти и другие наблюдения свидетельствуют о том, что АТР может быть сигнальной молекулой, обеспечивающей коммуникации между вкусовыми клетками. Необходимыми условиями выполнения подобной функции является наличие во вкусовой почке клеток, высвобождающих АТР, и клеток-мишеней, способных детектировать АТР во внеклеточном пространстве. Поэтому в работе ставились следующие основные задачи:
1. Установить, имеется ли во вкусовой почке популяция клеток, способных распознавать внеклеточный АТР, и если да, то описать феноменологию их возбуждения нуклеотидом.
2. Изучить последовательность событий, запускаемых АТР в цитоплазме вкусовых клеток, и охарактеризовать основные элементы пуринергического сигнального каскада.
3. Выяснить, происходит ли выброс АТР из вкусовых клеток в ответ на их стимуляцию.
Данная работа представляет собой попытку ответить на эти и некоторые другие вопросы, и посвящена исследованию внутриклеточных событий, запускаемых внеклеточным АТР во вкусовых клетках млекопитающих.
Первичные мессенджеры вкусовой почки
Так как вкусовые клетки подвергаются непрерывному обновлению, иннервация вкусовых почек также должна непрерывно меняться. Таким образом, оказывается, что для нормального функционирования вкусовых клеток необходимо наличие некоторого набора первичных мессенджеров для контроля над такими процессами, как клеточный цикл и изменение иннервации, вкусовая трансдукция и обработка информации, которые одновременно происходят во вкусовой почке. На роль подобного коммуникативного медиатора есть несколько претендентов.
С помощью метода иммуногистохимии во вкусовой почке были локализованы следующие нейроактивные вещества: ацетилхолин, норэпинефрин, серотонин, аминокислоты (например, глутамат и ГАМК) и пептиды (например, вещество Р и кальцитонин связывающий пептид) (Nagai et al., 1996; Yamomoto et al., 1998; Ganchrow, 2000). Хотя их роль в физиологии вкусовой почки достоверно не известна, вероятно, и они могут быть вовлечены в межклеточную сигнализацию. Для формирования внутриклеточного ответа на подобные регуляторные вещества вкусовые клетки могут использовать каскады усиления внешнего сигнала, что характерно для многих клеток и тканей (Suh and Hille, 2002). Несмотря на многообразие первичных мессенджеров, основными элементами цепи их восприятия и передачи сигнала остаются специфические рецепторы-белки на мембране, G-белки и различные ферменты биохимических каскадов, влияющие на уровень вторичных мессенджеров и, как следствие, на генерацию внутриклеточного ответа на внешнее воздействие. Такие механизмы усиления используются при гормональной регуляции и в фототрансдукции, они участвуют в процессах формирования памяти и развития (Fain et al., 2001; Eatock, 2000; Bunemann et al., 1999; Burns and Baylor, 2001).
Во вкусовых клетках был обнаружен ряд трансмембранных рецепторов, включая адренэргический, глутаматный, холецистокининовый, лептиновый, и мускариновый рецепторы (Chaudhari et al.,1996, 2000; Kawai et al., 2000; Ogura, 2002; Hemess et al., 2002a; Hemess et al., 2002b). Электрофизиологические эксперименты и Ca imaging указывают на то, что многие из обнаруженных медиаторов предположительно могут контролировать возбудимость вкусовых клеток путем регуляции потенциал-зависимых К , Са и СГ токов или мобилизируя внутриклеточный Са2+ (Delay et al., 1997; Hemess and Chen, 1997, 2000; Hemess and Sun, 1999; Kawai et al., 2000; Ogura, 2002; Hemess et al., 2002a; Hemess et al., 2002b; Obata et al, 1997; Ren et al., 1999). Как нейротрансмитер, глутамат может действовать и через метаботропный и через ионотропный рецепторы (Chaudhari et al.,1996, 2000; Toyono et al., 2002), что сопряжено с модуляцией тока покоя и/или мобилизации внутриклеточного Са2+ (Bigiani et al., 1997; Lin and Kinnamon, 1999; Caicedo et al., 2000).
Пурины (ATP, ADP и аденозин) и пиримидины (UTP и UDP) широко известны как медиаторы, ко-медиаторы или нейромодуляторы, действующие в периферийной и центральной нервных системах (Ralevic-and Bumstock, 1998; Galligan et al., 2000; Bumstock, 2001; Stojilkovic and Koshimizu, 2001; Dunn et al., 2001; Di Virgilio and Solini, 2002). Рецепторы на пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды подразделяют на две группы -Р1- и Р2-типа по сродству к агонистам - для первых это аденозин, а для вторых - ATP, ADP и UTP. Семейство рецепторов Р2-типа состоит их двух подсемейств, включающих ионоторопные Р2Х рецепторы и метаботропные P2Y рецепторы (Ralevic and Bumstock, 1998). Р2Х рецепторы являются катионными каналами, активируемыми экстраклеточным ATP (Dunn et al, 2001; North, 2002), и присутствуют как в пре-, так и в постсинаптических мембранах.
Поскольку нейромедиаторы часто выделяются вместе с АТР, активация пресинаптических Р2Х рецепторов, проницаемых для ионов Са +, создает положительную обратную связь, которая ускоряет секрецию нейромедиатора. В синапсах, в которых АТР секретируется как нейромедиатор, Р2Х рецепторы в постсинаптической мембране обеспечивают передачу возбуждения (Fields and Stevens, 2000). При повреждении тканей АТР высвобождается из клеток и активирует Р2Х рецепторы, локализованные на нервных окончаниях сенсорных нейронов, тем самым внося вклад в формирование болевого ощущения (Burnstock, 2001). Р2Х рецепторы, в свою очередь, подразделяются на 7 подклассов: от P2X1R до P2X7R (North, 2002). Также было обнаружено три гетеродимерных формы Р2Х рецепторов: ЗР2Х2/Р2ХЗ Р2Х1/Р2Х5 Р2Х4/Р2Х6 (Dunn, 2001; Di Virgilio and Solini, 2002). Каждый из подклассов Р2Х рецепторов имеет топологию, существенно отличную от топологии других известных лиганд - связывающих каналов. Р2Х рецептор - белок, состоящий из 378 - 472 аминокислотных остатков (два гидрофобных трансмембранных домена с большой экстрациркулярной гидрофильной петлей), размещенный в мембране и образующий в ней пору. Экстраклеточная петля всех подтипов Р2Х рецепторов содержит 10 консервативных цистеиновых и 14 консервативных глициновых аминокислотных остатка, а также от двух до шести сайтов для гликозилирования. Гликозилирование необходимо для экспрессии рецептора на клеточной поверхности и для его функции (Torres, 1998). Р2Х рецепторы различаются по их чувствительности к различным агонистам, антагонистам и катионной селективности. Существуют данные о том, что подтипы Р2Х рецепторов могут образовывать гетеродимеры, в частности комбинация Р2Х2 и Р2Х3 типов формирует уникальный ионный канал со специфическими свойствами.
Кальций - классический вторичный мессенджер
Цитозольный Са также может оказывать стимулирующие и ингибирующие эффекты на 1Рз рецепторы. Зависимость 1Рз 9-І индуцированного выброса Са от концентрации свободного цитоплазматического Са2+ имеет колоколообразный вид, так как IP3R имеет регуляторные участки для связывания ионов Са2+ и Са2+-связывающих белков (например, кальмодулина), которые обеспечивают положительную и отрицательную обратную связь для формирования полноценного Са2+-сигнала, предотвращая чрезмерное увеличение Са2+, опасное для клеток (Мак et al., 2001; Thrower et al., 2001). В частности, существуют данные подтверждающие, что ингибирование IP3R1 высокими концентрациями цитоплазматического Са2+ контролируется СаМ.
RyR рецепторы. RyR рецепторы - Са -управляемые Са каналы специфически связывающие растительный алкалоид рианодин, - впервые выделены из скелетных и сердечных мышц. RyR рецепторы является гомотетрамером, состоящими из мономеров с молекулярным весом 550 КД и имеет довольно значительную гомологию с 1Р3 рецептором и небольшую с потенциал-зависимыми Са каналами (Shoshan-Barmatz and Ashley, 1998). На данный момент у млекопитающих идентифецировано три изоформы RyR рецептора RyRl, RyR2 и RyR3, которые кодируются тремя различными генами. Эти рецепторы довольно широко распространены в различных типах ткани, но наибольшая их часть сосредоточена в мышцах (Airey et al., 1993; Fill and Copello, 2002; Williams et al., 2001)
Скелетные мышцы обладают механизмом освобождения Са2+, вызываемым деполяризацией - дигидропиридин-чувствительные Са2+ каналы плазматической мембраны служат потенциал-чувствительными передатчиками активирующего сигнала непосредственно Са2+ каналам сарколеммы (RyRl-тип) через связывающие белки и прямо активируют освобождение Са из СР (Tanabe et al., 1993; Proenza et al., 2002; Protasi, 2002). В сердечных мышцах RyR рецепторы I типа непосредственно связаны с высокопороговыми Са каналами плазматической мембраны (L-тип) через кальцийсвязывающие белки и образуют единую функционально активную структуру. Для RyR2-rana рецепторов СР кардиомиоцитов, не связаных с плазмалеммой, требуется увеличение концентрации цитозольного кальция для стимуляции освобождения Са2+ из депо. Кроме этих двух типов Са -активируемых Са каналов, недавно был идентифицирован третий тип Са каналов ЭР (RyR3-ran), который является продуктом другого гена. Как было показано, этот третий тип Са каналов ЭР не чувствителен к кофеину (Williams et al., 2001; Fill and Copello, 2002). RyRs имеют несколько мест регуляции, которая осуществляется Са2+ (колоколообразная зависимость) (Chen et al.,1998; Jeyakumar et al.,1998), ATP (Copello, et al 2002; Coronado, et al.,1994), кальмодулином (CaM) (Chen, et al., 1997; Fruen, et al., 2000), иммунофилином и кальциневрином (Williams et al., 2001). Рецептор фосфорилируется СаМ-зависимой протеинкиназой II (СаМКП) и дефосфорилируется кальциневрином. СаМКИ фосфорилирует все три изоформы рецептора, что приводит к его активации. Показано, что РКА и cGMP-зависимая протеинкиназа также способны фосфорилировать этот же сайт. Фосфорилирование этого сайта сАМР-зависимой протеинкиназой, в частности при стимуляции р-адренорецептора, активирует сердечную изоформу RyR (Hain, et al., 1995; Lokuta, et al., 1995). Кальциевые каналы плазматической мембраны.
Среди Са2+-транспортирующих ионных каналов выделяются три основные группы с учетом преимущественных механизмов, контролирующих их активность: потенциал-зависимые (VG, voltage-gated, рецептор-управляемые (ROC, receptor-operated channels), и уже упоминавшиеся SOC/CRAC каналы, которые активируются при опустошении кальциевых депо.
Потенциал-зависимые Са2+-каналы. В электровозбудимых клетках VG Са2+-каналы обеспечивают основной поток внеклеточного Са2+ в их цитоплазму, хотя Са каналы других типов также могут участвовать в переносе Са2+. При потенциале покоя (-60-70 мВ) VG Са +-каналы находятся в неактивном состоянии, а их активация происходит при деполяризации мембраны. Идентифицировано несколько типов VG Са -каналов (L-,T-, N-, Р-, Q-, R- типа), которые отличаются друг от друга активацией, кинетикой, проводимостью и фармакологией. Активность VG Са2+-каналов плазмалеммы может регулироваться различными внутриклеточными вторичными посредниками (cAMP, cGMP) (Kraus-Friedmann, 2000), непосредственно G-белками (Dolphin, 2003), а также в результате фосфорилирования РКА, PKG, РКС (Са активируемая протеинкиназа) и СаМКП. Возможна также регуляция различными метаболитами арахидоновой кислоты и непосредственно самой арахидоновой кислотой.
Метод микрофотометрии и экспериментальная установка
Были исследованы вкусовые почки из листовидных сосочков (п = 26), однако существенных отличий в чувствительности вкусовых почек к АТР в зависимости от типа вкусового сосочка обнаружено не было. Порог чувствительности составил около 100 нМ АТР, насыщающие ответы достигались при 100-500 мкМ АТР.
Зависимость амплитуды кальциевых ответов от концентрации нуклеотидов хорошо аппроксимировалась уравнением Хилла А[Са2+] = А/(1+(ЕС5о/С)п), где А и ЕС50 - величина насыщаемого ответа и полумаксимальной концентрации соответственно. За величину ответа принималась разница между [Са2+]цит в пике и [Са2+]цит непосредственно перед аппликацией агониста. Расчёты показывают, что А = 235 нМ, 210 нМ, и 131 нМ, ЕС50 = 1.8 мкМ, 11 мкМ, и 2.2 мкМ, п = 0.78, 0.72, и 0.74 для АТР, UTP, и ADP соответственно (Рис.4). По этим результатам можно предположить, что АТР и UTP являются полными агонистами пуринорецепторов вкусовых клеток, тогда как ADP- частичный агонист (Burnstock, 2001).
Пуринорецепторы опосредуют действие экстраклеточных нуклеотидов во многих клеточных системах (Vassort et al., 2001, von Kugelgen et al., 1994) и ингибируются неспецифическим ингибитором сурамином, что было показано и для вкусовых клеток. Аппликация специфических агонистов (2-метил-тио-АТР (2MeS-ATP) для P2Y рецепторов (п = 9) и бетта-гамма-метилен-АТР (Р,у-М-АТР) для Р2Х рецепторов (n = 7) показала, что главным образом P2Y рецепторы определяют чувствительность ВРК к экстраклеточному АТР (Барышников и др., 2002, Baryshnikov et al, 2003). Можно поэтому думать, что именно метаботропные пуринорецепторы экспрессируются во вкусовых клетках и обеспечивают их чувствительность к АТР и другим нуклеотидам.
RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) анализ транскриптов P2Y рецепторов во вкусовой ткани, проведенный в нашей лаборатории Яценко Ю.Е. и Быстровой М.Ф., подтвердил это предположение. Выделенная из тотального препарата вкусовой ткани mPNA (5-7 независимых экспериментов) с помощью реакции обратной транскрипции переводилась в cDNA, которая анализировалась при помощи PCR с использованием ген-специфических праймеров. Последние подбирались к генам, кодирующим P2Yb P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Yj2. В результате проведённого анализа было показано, что во вкусовых клетках экспрессируются пуринорецепторы P2Y(, P2Y2, P2Y4, и P2Y6 типа. (Рис. 5).
Были исследованы вкусовые почки из листовидных сосочков (п = 26), однако существенных отличий в чувствительности вкусовых почек к АТР в зависимости от типа вкусового сосочка обнаружено не было. Порог чувствительности составил около 100 нМ АТР, насыщающие ответы достигались при 100-500 мкМ АТР.
Зависимость амплитуды кальциевых ответов от концентрации нуклеотидов хорошо аппроксимировалась уравнением Хилла А[Са2+] = А/(1+(ЕС5о/С)п), где А и ЕС50 - величина насыщаемого ответа и полумаксимальной концентрации соответственно. За величину ответа принималась разница между [Са2+]цит в пике и [Са2+]цит непосредственно перед аппликацией агониста. Расчёты показывают, что А = 235 нМ, 210 нМ, и 131 нМ, ЕС50 = 1.8 мкМ, 11 мкМ, и 2.2 мкМ, п = 0.78, 0.72, и 0.74 для АТР, UTP, и ADP соответственно (Рис.4). По этим результатам можно предположить, что АТР и UTP являются полными агонистами пуринорецепторов вкусовых клеток, тогда как ADP- частичный агонист (Burnstock, 2001).
Пуринорецепторы опосредуют действие экстраклеточных нуклеотидов во многих клеточных системах (Vassort et al., 2001, von Kugelgen et al., 1994) и ингибируются неспецифическим ингибитором сурамином, что было показано и для вкусовых клеток. Аппликация специфических агонистов (2-метил-тио-АТР (2MeS-ATP) для P2Y рецепторов (п = 9) и бетта-гамма-метилен-АТР (Р,у-М-АТР) для Р2Х рецепторов (n = 7) показала, что главным образом P2Y рецепторы определяют чувствительность ВРК к экстраклеточному АТР (Барышников и др., 2002, Baryshnikov et al, 2003). Можно поэтому думать, что именно метаботропные пуринорецепторы экспрессируются во вкусовых клетках и обеспечивают их чувствительность к АТР и другим нуклеотидам.
RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) анализ транскриптов P2Y рецепторов во вкусовой ткани, проведенный в нашей лаборатории Яценко Ю.Е. и Быстровой М.Ф., подтвердил это предположение. Выделенная из тотального препарата вкусовой ткани mPNA (5-7 независимых экспериментов) с помощью реакции обратной транскрипции переводилась в cDNA, которая анализировалась при помощи PCR с использованием ген-специфических праймеров. Последние подбирались к генам, кодирующим P2Yb P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Yj2. В результате проведённого анализа было показано, что во вкусовых клетках экспрессируются пуринорецепторы P2Y(, P2Y2, P2Y4, и P2Y6 типа. (Рис. 5).
Наличие RT PCR-сигнала от языкового эпителия, не содержащего вкусовой ткани, косвенно подтверждает более раннюю идею функционирования P2Y рецепторов в различных эпителиальных тканях (Bailey et al. 2004; Klepeis et al. 2004). RT-PCR показал наличие P2Yb P2Y2, P2Y4 и P2Y6 изоформ, a физиологические эксперименты установили их функционирование на плазмалемме мышиных вкусовых клеток. Эти изоформы рекомбинантных P2Y рецепторов характеризуются различной чувствительностью к нуклеотидам (Таб. 1).
Меньший ответ на ADP и UDP (агонисты для P2Y! и P2Y6 изоформ соответственно), вероятно обусловлен более низкой экспрессией P2Yi и P2Y6 по сравнению с P2Y2 и P2Y4. Идентифицированные нами P2Y2 и P2Y4-изoфopмы распознают АТР как полного агониста, который так же может быть частичным агонистом для P2Y] (но не UDP, Waldo and Harden 2004). Помимо этого, P2Yi может стимулироваться за счет появления ADP в растворе АТР в результате деградации последнего эктонуклеазами (Matsuoka and Ohkubo, 2004). Следует однако отметить, что при насыщающих концентрациях АТР и UTP мобилизовали внутриклеточный Са с равной эффективностью и намного более эффективно, чем ADP и UDP (Рис. 4). Кроме того, BzATP, антагонист P2Yi рецепторов (n = 11) (Vigne et al. 1999), вызывал Са ответы, сопоставимые по амплитуде с ответами на АТР (Федоров И.В. и другие, 2005). В своей совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что вклад P2Yr и Р2Уб- рецепторов в ответы вкусовых клеток на внеклеточный АТР является незначительным (Bystrova et al., 2006). Проведенные эксперименты (Рис. 4) и литературные данные (Таб. 1) дают основание думать, что ответы на внеклеточный АТР и UTP в основном формируются за счет активации P2Y2 и/или P2Y4 изоформ пуринорецепторов.
Итак, возможна активация фосфоинозитидного каскада, аденилатциклазного каскада, модуляция ионных каналов непосредственно G-белками, или может иметь место одновременное участие двух или нескольких из этих каскадов (Burnstock, 2001; Di Virgilio and Solini, 2002). Установив, какой именно G-белок вовлечен в передачу сигнала от P2Y рецептора, возбужденного АТР, можно предвидеть с большой вероятностью какой именно сигнальный каскад (фосфоинозитидный или/и
сАМР-зависимая регуляция чувствительности вкусовых клеток к внеклеточному АТР
Многочисленные данные свидетельствую о том, что внеклеточный АТР является сигнальной молекулой и в качестве первичного посредника может быть вовлечен в такие процессы, как синаптическая передача, формирование болевого ощущения и паракринная регуляция (North and Barnard, 1997; Burnstock, 2001).
Вкусовые рецепторные клетки детектируют химические стимулы, попадающие во вкусовую пору, и передают информацию о них далее, вкусовому нерву. В настоящий момент нейромедиатор, участвующий в этой передаче, однозначно не определен. В принципе, АТР мог бы играть роль такого медиатора. Подобно тому, как это показано для других тканей, АТР может быть использован клетками вкусовой почки и для автокринной/паракринной регуляции клеточных функций. Вполне возможно, что АТР выбрасывается эфферентными нервными окончаниями и тем самым модулирует физиологические функции вкусовых клеток. Следует также отметить, что АТР является компонентом свежей пищи, в силу чего рецепция АТР вкусовыми клетками представляет собой часть механизма вкусовой трансдукции. Наш метод исследования Са2+ ответов вкусовых клеток на внеклеточный АТР, не позволяет установить локализацию P2Y рецепторов на мембране клеток, следовательно, мы не можем однозначно судить о роли АТР во вкусовой почке. Ответить на вопрос «Какую физиологическую роль выполняет АТР во вкусовой почке?» может поиск источника АТР, который стимулирует клетки-мишени.
Наиболее привлекательная идея, на наш взгляд, состоит в том, что АТР высвобождается клетками вкусовой почки и является первичным посредником в межклеточных коммуникациях.
Традиционно концентрация АТР во внеклеточной среде измеряется с помощью люциферрин-люциферазной реакции. Чувствительность люциферрин-люциферазного метода достаточно высока (пМ), что позволяет детектировать высвобождение АТР в препаратах тканей и клеток. Однако этот метод требует достаточно большого количества клеток ( 10 ), поэтому данный подход не применим для исследования выброса АТР из одиночной клетки, изолированной из вкусовой почки.
Альтернативным подходом является использование АТР-чувствительных клеток, т.е. АТР-биосенсоров (Yi-Jen Huang, 2005), что дает возможность зарегистрировать предполагаемый выброс АТР из одиночной вкусовой клеткой при одновременной регистрации активности последней. Отметим, что для АТР-чувствующих вкусовых клеток пороговая концентрация АТР составляет около ЮОнМ, поэтому, если источником АТР в межклеточном пространстве являются соседние клетки вкусовой почки, то они должны выбрасывать соответствующее количество АТР, чтобы обеспечить межклеточные коммуникации. Учитывая, что расстояние между клетками во вкусовой почке порядка 0.01 мкм, что недостижимо в реальном эксперименте при сближении клетки АТР-источника и клетки АТР-сенсора, нетрудно видеть, что чувствительность АТР-биосенсора должна быть не хуже ЮОнМ.
В поисках эффективного АТР-биосенсора нами были протестированы клетки линий НЕК-293, трансфецированных плазмидой, несущей ген Р2Х рецепторов, и COS-1, которые экспрессируют эндогенные P2Y рецепторы, сцепленные с фосфоинозитидным каскадом. Эти клеточные линии представляют собой эффективную экспрессионную систему и часто используются для экспрессии чужеродных генов. Клетки обеих линий были протестированы на чувствительность к АТР микрофотометрическим методом с использованием проникающего флуоресцентного кальциевого зонда Fura-2 и Fluo-4. Эксперименты проводились на одиночных клетках, которые помещались в перфузируемую фотометрическую камеру при температуре 24 - 27С.
Опыты показали, что АТР вызывает повышение внутриклеточного Са в обоих типах клеток. Клетки НЕК-293 (n = 19) хорошо отвечали на 10 мкМ АТР, но большинство оказалось неспособно эффективно детектировать АТР, апплицированный в концентрациях 1мкМ и меньше (данные не приведены).
