Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди различных методов анализа хромосом одним из аиболее современных и эффективных является цитометрия и сортировка в потоке. Этот ме-эд позволяет не только с большой скоростью получать базовые количественные характери-гики всех хромосом, составляющих геном, но и проводить выделение фракций отдельных ромосом, что актуально при проведении работ по созданию хромосом-специфичных клоно-гк. Высокая скорость анализа и его объективность определили быстрое развитие этого ме-эда и его современную популярность.
Данная работа посвящена количественному анализу хромосом человека в потоке. Ин-ормация о хромосомном наборе заключена в экспериментально получаемых статистиче-шх распределениях интенсивностей флуоресценции хромосом. Обработка эксперименталь-ых данных имеет несколько целей: определение относительного размера хромосом, состав-ыощих кариотип; соотнесение пиков на гистограмме (проточном кариотипе) с конкретны-и хромосомами; детекция хромосомных перестроек в исследуемой линии клеток; опреде-ение оптимальных параметров для сортировки хромосом, а также оценка чистоты иолучае-ых хромосомных фракций. В подавляющем большинстве современных работ такой анализ роводится лишь визуально, что не позволяет получить значительную часть потенциально оступпой информации. Создание методов количественного анализа проточных кариотипов озволит увеличить информативность подхода и объективность получаемых сведений.
Цель работы - расширение аналитических возможностей метода проточной ци-зфлуориметрии в применении к хромосомам путем создания средств количественной об-їботки результатов цитофлуориметрического анализа хромосом, реализованных как серия рограммных пакетов для доступных персональных компьютеров ЮМ. Это позволит полу-ш> объективную количественную информацию о экспериментальных распределениях, и, іедовательно, расширить как аналитические возможности метода, так и область применена хромосомного анализа для серийных клинических приложений.
Научная новизна. Создана процедура количественного анализа проточных ка-аотипов, работающая в интерактивном режиме и позволяющая учитывать при анализе ап-иорную информацию об объекте. Процедура, являясь комбинированной, обеспечивает на їждом этапе анализа альтернативные методы обработки данных, что обеспечивает гибкость выработку оптимальной стратегии анализа. При анализе используется принципиально по-ай метод фильтрации примесных сигналов в экспериментальных разложениях с использо-
ванием быстрого преобразования Фурье. Предложена модель изменения формы функции, описывающей примесные сигналы, обусловленные наличием в исходной суспензии обломков хромосом и клеточных фрагментов. Принципиальная модификация существующих методов разложения экспериментальных результатов на элементарные компоненты основана па комбинировании существовавших методов анализа с введением физической модели t процесс разложения, что позволило сделать процедуру разложения устойчивой и имеющее физический смысл.
Тестирование процедуры продемонстрировало высокое разрешение комплекса методов анализа (высокая достоверность определения относительных размеров хромосом) и устойчивость процесса разложения. Точность анализа обеспечивает детектирование хромосомных различий н перестроек размером до 500 000-700 000 пар нуклеотидов, что являете} рекордной точностью. К тому же, примененные методы визуализации двупараметрическш распределений позволяют практически безошибочно идентифицировать пики хромосом.
Практическая ценность. Разработанные методы анализа были применены і анализу экспериментальных данных, полученных на лазерном проточном цитофлуориметр АТС-3000 (Brucker). Практическим результатом работы являются работоспособные про граммные пакеты для персональных компьютеров, что делает анализ хромосом человека і потоке доступным не только для лабораторий, но и для серийных клинических применений Более чем двухлетний опыт использования разработанного подхода показал его эффектив ность и надежпость. Программные пакеты переданы пользователям, работающим над про блемой хромосомного анализа в рамках ГНТПР "Геном человека".
Апробация работы. Основные результаты докладывались на Всесоюзных и Все
российских научных конференциях "Геном Человека" (1991, 1993); на международных кон
грессах: XV Congress of International Society for Analytical Cytology (1991), XVII Congress (
International Society for Analytical Cytology (1994). Программные пакеты апробировались
использовались в Группе цитометрии и выделения хромосом Института Молекулярной Бис
логии РАН (Москва), а также в Институте цитологии РАН (С.-Петербург), и на XV]
Congress of International Society for Analytical Cytology (Lake Placid, USA).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из 8 глав, включающих вве
дение, выводы, заключение и приложение. Главы 2-4 посвящены анализу результатов одне
параметрического анализа, глава 5 - анализу результатов двупараметрического анализа. Ди<
сертация содержит обзор литературных данных согласно темам глав. Диссертация изложен
на страницах, содержит б таблиц и 23 рисунка. Библиография включает 57 наименовг
ний.