Введение к работе
Актуальность исследовании Эритроциты иа всех клоток организма наиболее подіюржеїш окислитель
НОЙ ДОСТрУКЦИИ II СВЯЗИ С ПООТОН1ІШІМИ процессами ОКПИІЧ.'ШЩИіі Д
НИИ, м результате которых с опродолонной іюіхлтгпостно огіїюоуіігі'си кисло роді то радикгіли и перекись водорода (Ніяга II. et al., 1!І72; Могнн Н 1908). Последняя является далгхлииущим, хорошо проникающим чиїизз биоло гичоскио мембрани соединением, способным окислить гемоглобин и другие физиологически вахіїиа макромолекули (Таяависіїі Т. et at., 191S3; Такапяа hi И. et al.. іавО).
Степень токсичности перекиси іюдорода опродешмитеи соотношением ну той ео метаболизма, среди которих можно оцдслить дво группы:
-
ферментатипиш: каталаїїний и перокси/ілцішй пуги, но снизанный с генерацией кислородных радикалом;
-
нефериентнтквпые: разложение перекиси водоїхіда при нзаимодойїгс вий с ионами металлов поромонной валентности <ію типу реакции Фонтома), с Некоторыми органическими молекулами. При :>том генорируиггсй несьма і*»-акіїиоішоспособний и токсичний гидроксил-радикал и другие кислоіюдние ра цикали.
- По мнении ряди авторов (Мізга II. et al., 1072; Yanaguchi Т. et ні., ІИПЗ) н перекисной деструкции эритроцитов осіюьную ролі, играот окислиііио іерокиоио іюдоіюдії гемоглобина, нлокунцзе за аххй деструкцию мембрани, Зднако механизм этого окисления в физиологических условиях неизвестен, tor, в частности, нсности в следующих вопросах: перекисью или оораэующн «іся при оа їмспадо радикалами окисляется і'ємоглобин? Ногех.нгдстоонно їли опосредоваї ню поражаются ш»і этом ого активные центры? Генерирует ли :аи гемоглобин в процессе его піювращєиия п мотп^могдоыт amuiiiud форгш іислоіюда? Наконец, какую роль играет образующийся в процессе- перекисной (еотрукции г-омоглооина мштгемоглобиц? В отношении нетгемоглобшш и:і
постно, что он способен катализиронать окислош» перекисью водорода ряда физиологически важных веществ, о частности, лскорбдта (Коі 1 in D. et a 1.. ІНЗ.'і; D.'iljtiM К. о I. «1., 10Ь7). Однако, не ясно, имоот ли здесь носто классическая пероксидаэнан реакции, или же процесс сопрядон со свободио-радикалышм разрушенной ПгОв?
"от ясности и о иопросо о той, какова роль Каталапи и глутатиошго-рокскдазы а защите эритроцитов от порокисной деструкции, что, по-видимому, обусловлено отсутствием соводаешшх методик определении физиологической эффективное, л данных фсрмннтон в биообъектах, а потому клинические даїшіію об их роли чрезвычайно противоречивы (Aebi Н. el а!.. 1971; Cohen С. et al., 1863).
Тем но менее, по кивигао ряда авторов (Cohen G. at пі., 1864; Mora» H., 1908) поракисішя деструкция гемоглобина является составной часты» большиїїстоа гемолитических процессоо, а в ряда . случаев играет в пих віуучую роль (Cohen G. et аі... 1064}.
Учитывая выше сказанное, вопрос о мвханмэмо взаимодействия гемоглобина с ИяО.. и его защиты от окислительной деструкции пилится актуальный ка с точки зрения фундаментальной науки, так и в споти возможности.раскрытия механизма возникновения 1 да генолитичооких анемий.
Цель и задачи исследования
Целью пастоящей работы являлось выясвевие механизма веракисной лесрукции гемоглобина под действием субфизиологичоских концентраций НаОа, а также роли Ферментативних и неформептативиых антиокиедмтвлой в его защите.
В работе били поставлены и решались следующие задачи:
-
Разработка методик, с помощью которых было бы возможно дифферпга-цироиать пути метаболизма иерекиси и оіцюдалять эфФоктиоиость фуикцио- вироьания антиокислительнмх форментов.
-
Выяснить механизм перакисиой деструкции гемоглобина при физиоло-
гичосюис концентрациях ІІзОз. ііугем піхисіієішіі лоиушеж кислородник радик&лоа ощх'Лелить роль последних о данном процессе.
3) ПУТЄМ ГіримеНОНИЯ СПОЦИфИЧеОКИХ ЫКЖПТОрОН ГІШІСІІИТЬ РОЛЬ ЦкгрМОП
татипных антиокислителей d :іащито іч-моглоОина от порнкисцой деструкции.
4) Исслодонать механизм порокои/изного окислі.'ііия «іскори-дта кил одного из возможных зиеньео пзаимодойстізия форментатипних и нофернеп татишіих антиокислителей в защито эритроцитов от окисли-іізлмюй деструкции.
Ь) Установить, имоотсй ли соотиатстпио между механизмами окислення перекись» водорода ряда вещестн, катализируемыми мот-гемоглобином и іи»-роксидлзой хрена.
Научная новизна
С помоцы» калориметрического метода Шюреыв экспериментально определен теожжюА зффект клталазного, гюроксндазноГо и сіюбодно(кщикальіюіч) (по тип/ реакции . Фептона)- процессов- ра-июхенмя перекиси водоїхіда. Определенные вами величини теплового эффекта указанных прощч:сов раніш соотвотствеїшо 20.24, ви.25 и 50.й ккал в расчета па 1 ноль разрушенной перекиси. Из этого такхо следует, что тенлоізон аффект разложении ІЬОа зависит от пути со метаболизма.
Іінерв»» на еритроцитах и их гвмолиэатах. а такхо на изолированном гемоглобине показано, что г>--могло5ин в аэробных услоиикх способен подвергаться цепному процессу окисления до мотгемоглобипа, индуктором и м<>-днатоіюм которого ишіяетея перекись водорода» образующаяся в процессе <1в novo. Данный процесс предотвращается каталаэой. Аитнр^иіикальнііо пропыхти ь-гистидии и tt-токоферол но оказывают на него никакого влияния.
Покапано, что метгемоглобіні способен катализировать окисление перекись» ьодріюда аскорбата и некоторых других веществ как обычная гемоиаи пероксидазл с тем кк тчишопнм эффектом; какого-либо влияния на этот про-цес-e аптирадикальние іцюнарати не оказывают.
Также, благодари применению калориметрии, вперше установлено, что иороксидагиюо окисление аскорбата, вопреки угоердигоїимої в литература ожемам (Yuimr.aki I., 1957). реализуется ио мохаиилму, включающему две стадии: ферментативную и нефермснтатгаїнуп. Вклад последней увеличивается с ростом рН среды, вследствие чего стохиометричоское соотновенио между разрушенной перекисью и окисленным аскорбатон также возрастает с увеличением рН. Иэ-эа отсутствия у продуктов окисления аскорбота характерных максимумов в видимой и в ультрафиолетовой областях спектра с одной сторони, и нсіжхиажіь-оти контроля содержания перекиси титромотричоскими методою» її системо, содержащей аскорСат, с другой сторони, данную нофор-ментатшшуп стадію процесса невозможно било зафиксировать оптическими потопами.
Научно-практическая значимость работы
Настоящая работа может быть отнесена к области фуіі/ямвяталиаих исслодої «ний .
Калориметрический метод, раэработаипый и обоснованный в данной рг. оте, может бить принемоп для оиродмлсшил католитичоской эффективности каталазы и пороксидазы в биообг-іктах, как в иаучнше исследованиях так и v стшико.
Обнаруженное и работа явленно индуцированного перекисью водорода аутоокислоаня гемоглобина, по-видимому, иодот быть ключевым эоевом ряда ге».олитичоских процессов. Л потому устойчивость гемоглобина к путоохме-лению, зависящая от интегральной эффективности антиокислительных систен эритроцитов может Сыть важним диагностический параметром для оценки предрасположенности к гемолитическим кризам.
В рабиго отмечены иодостотки сучестоугади* методой опрш№>юкия малых концентраций перекиси водорода в GwxrfivoKTax, основавнцх >іа применении імроксидазной реакции с использованием субстратов, дающих при окислении-продукты, способные флуоресцировать, либо индуцировать хомилюминес-
ценцию, с последующей регистрацией в аналитических целях отих параметров
((Fletcher Н. et al., 1982). Из-за пдосутешии а объекте гюстапоинтолой
(аскорбат, глутатион) и тушителей хємилюминесцеицни, результати получен
ныв при помощи выше указанных методик могут бить существенно искажены.
Поэтому, нами для определения микроколичеств перекиси водоіюда в био
объектах предложено использовать эритроциты, в которых каталаза ииакти
вирована азидом натрия, как биюдетектор на НзОэ. Вследствие запуска по-
'рекисыо водорода процесса цепного аутоокислония гемоглобина в зритіюци-
?тах при таких условиях, данный метод позволяет с высокой точностью (до
$ 10-тН> . измерять концентрации] перекиси водорода в Биоо&ьвктах, вне зави
"симости от содержания в них восстановителей и тушителей.
Апробации работы
,-, Результаты работы были доложены и обсуждены па заседании майи
:Э0 марта 1930г., а также на совместной конференции кафедры биофизики
.меднко - биологического факультета РГМУ и отдела биофизики ПИИФХМ
2G января 1993г.
Публикации Основное содержание диссертации изложено в В печатных работах.
Структура и объем диссертации