Метаболизм циклического гуанозин-3',5'-монофосфата в растительной клетке. Связь с процессами внутриклеточной сигнализации Дубовская, Людмила Вячеславовна

Введение к работе

Актуальность темы диссертации

Хорошо известно, что в роли вторичного медиатора в регуляции метаболизма животных организмов выступает циклический гуанозин-3',5'-монофосфат (цГМФ). Недавно были получены косвенные свидетельства участия цикломоно-нуклеотида в ряде важных регуляторных процессов в высших растениях, базирующиеся на функциональных ответах клетки. Однако в настоящее время трудно оценить физиологическую значимость многих ответов растений на действие цГМФ, поскольку внутриклеточная концентрация цГМФ пока достоверно не оценена, механизм его действия не изучен, а вопрос о функционировании системы метаболизма цГМФ не разрешен.

Известно, что в поддержании эндогенного уровня цГМФ в животной клетке принимают участие ферменты его анаболизма и катаболизма - гуанилатцшшаза (ГЦ) и фосфодиэстераза (ФДЭ) соответственно. К сожалению, о содержании, локализации и функционировании данных ферментов в растительной клетке информации мало. Имеются лишь отдельные работы, в которых определена удельная активность ГЦ и ФДЭ в растениях. Более того, в отличие от животных, растительные гены, кодирующие ГЦ и ФДЭ, пока не расшифрованы и не клонированы. Данные о физиологической роли ферментов метаболизма цГМФ в растительной клетке и их возможном участии в процессах сигнальной трансдукции в растениях также отсутствуют, а механизм действия гуанозинцикломононуклеотида на молекулярном уровне совершенно не изучен. Следовательно, представлялось важным исследовать систему метаболизма цГМФ в растительной клетке и ее участие в таких процессах сигнальной трансдукции в высших растениях, как передача светового и фи-тогормонального сигналов.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнялась в рамках Государственной программы фундаментальных исследований по теме «Циклические мононуклеотиды - вторичные медиаторы процессов внутриклеточной сигнализации в растениях» № ГР 20015172 (2001-2005 гг.) и гранта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований по теме «Метаболизм цГМФ в растительной клетке» № ГР 2022723 (2002-2004 гг.).

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является характеристика системы метаболизма цГМФ в проростках овса, а именно, определение кинетических параметров ферментов синтеза и распада цГМФ - ГЦ и ФДЭ соответственно, установление возможного модулирующего действия фитохромной и фитогормональной регуляторных систем на активность этих ферментов, а также оценка связывающей активности цГМФ структурными компонентами субклеточных фракций.

Поставленная цель включает решение следующих задач:

- Оценить эндогенную концентрацию цГМФ в тканях растений и его воз
можное участие в трансдукции внешних сигналов. _ _кі

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ |
БИБЛИОТЕКА
, С. Петербург |

800 уРК j

Изучить локализацию в клетке и основные характеристики ферментов метаболизма цГМФ.

Исследовать влияние G-белков и системы Са²⁺/кальмодулин на активность ГЦ и ФДЭ.

Выяснить возможность регуляции ферментов обмена цГМФ светом и фи-тогормонами.

Оценить связывание цГМФ растительными клеточными компонентами и исследовать различные субклеточные фракции на присутствие цГМФ-связывающих центров.

Объект и предмет исследования

В качестве основного объекта исследования выступали первичные листья проростков овса (Avena sativa L.), а также листья ячменя (Hordeum vulgare L.), пшеницы (Triticum aestivum L.) и табака (Nicotiana plumbaginifolia). В работе использовали экстракты растительной ткани, протопласты и изолированные фракции растительных клеток. Предметом исследования в данной работе было изучение системы метаболизма цГМФ в растениях и ее участия в процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке.

Гипотеза

Выдвигается предположение о том, что в растительной клетке функционирует система цГМФ, сходная с системой, охарактеризованой в клетках животных и совершенно не исследованная в растительной клетке. Предполагается, что механизмы синтеза и деградации цГМФ в растениях и животных одинаковы, поэтому в растениях также должны быть представлены гуанилатциклазная, цГМФ-гидролизующая фосфодиэстеразная и цГМФ-связывающая активность. Система метаболизма цГМФ, вероятно, играет в высших растениях ключевую роль в передаче, по крайней мере, световых и фитогормональных сигналов.

Методология и методы проведенного исследования

В работе использовались седиментационный, хроматографический и элек-трофоретический методы разделения биологических компонентов и радиоизотопный, радиоиммунологический и спектрофотометрический методы анализа.

Научная новизна полученных результатов

Работа является первым исследованием роли света и фитогормонов в регуляции активности ферментов метаболизма цГМФ в высших растениях. Полученные результаты подтверждают возможность применения к клеткам проростков овса цикломононуклеотидной концепции реализации биологического действия данных стимулов, подразумевающей участие цГМФ в качестве вторичного посредника.

Показано, что в клетках проростков овса присутствует функционально активная система метаболизма цГМФ. Установлена ее функциональная связь с фо-томорфогенетическими рецепторами высших растений. Активность ферментов обмена цГМФ в проростках овса и, следовательно, концентрация цГМФ, модулируются красным и синим светом, адресованным фитохрому и криптохрому соответственно. Показана обратимая регуляция активности ГЦ и цГМФ-

гидролизугощей ФДЭ этиолированных проростков при освещении их красным / дальним красным светом, поглощаемым фитохромом. Получены также данные, свидетельствующие об участии указанных ферментов в процессах фитогормо-нальной регуляции. Показано участие G-белков и системы Са²⁺/кальмодулин в регуляции синтеза и деградации цГМФ в растениях.

Совершенно новыми являются данные о цГМФ-связывающей активности в растительных субклеточных фракциях. В клетках проростков овса обнаружены центры специфического связывания цГМФ белковой природы, сродство которых к цикломононуклеотиду контролируется Са²⁺, кальмодулином, гуанозинтрифосфа-том (ГТФ) и светом, по всей видимости, с участием фитохрома.

Практическая значимость полученных результатов

Полученные данные расширяют существующие представления о процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке, в частности, о транс-дукции фотохромного и фітогормонального сигналов. Результаты диссертационной работы имеют практическое значение и являются важными для понимания и дальнейшего изучения механизмов фотоморфогенеза как основы онтогенеза высших растений. Биохимические параметры системы метаболизма цГМФ могут быть использованы как тест на функциональное состояние растительной клетки. Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций по биофизике, фотобиологии, биохимии и физиологии растений. Кроме того, полученная информация о молекулярных механизмах трансдукции в растениях таких модулирующих сигналов, как, например, биологически активные соединения, фитогормоны и свет, могут использоваться при разработке приемов оптимизации процессов роста и регуляции развития растений, в частности, такой практически важной сельскохозяйственной культуры, как овес.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В клетках проростков овса присутствует функционально активная система метаболизма цГМФ, представленная мембрано-связанной ГЦ, растворимой цГМФ-гидролизующей ФДЭ и центрами специфического связывания цГМФ.

2. Ферменты метаболизма цГМФ участвуют в процессах световой и фи-тогормональной регуляции в проростках овса и находятся под контролем фитохрома и криптохрома при участии G-белков и системы Са²⁺/ кальмодулин.

3. В субклеточных фракциях проростков овса представлены центры специфического связывания цГМФ белковой природы, сродство которых к цикломононуклеотиду контролируется Са²⁺, кальмодулином, ГТФ и светом с участием фитохрома.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации

Основные результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Внутриклеточная сигнализация в растительных и животных системах»

4 (Минск, 2000 г.), TV съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков: Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем (Минск, 2000 г.), Международном симпозиуме «Внутриклеточная сигнализация в растительных и животных системах» (Киев, 2001 г.), Шестой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва,

2001. г.), школе-семинаре для молодых ученых Федерации Европейских биохимических обществ (ФЕБО) «Химические зонды в биологии» (Спецес, Греция, 2002 г.), Форуме для молодых ученых ФЕБО (Стамбул, Турция, 2002 г.), Пятом съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск,

2002. г.), школе-семинаре «Клеточная сигнализация», организованной Международной организацией клеточных исследований и Европейской молекулярно-биологической организацией (Шанхай, Китай, 2002 г.), школе-семинаре для молодых ученых ФЕБО «Технология рекомбинантных ДНК и экспрессия белков» (Бухарест, Румыния, 2003 г.), Втором немецко-белорусском симпозиуме «Формирование и функционирование фотосинтетического аппарата» (Эгсдорф, Германия,

2003. г.), Республиканской конференции молодых ученых Национальной академии наук Беларуси «Молодежь в науке» (Минск, 2003 г.).

Опубликованность результатов

По теме диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах и 11 тезисов докладов. Общее количество опубликованных страниц - 39.

Структура и объем диссертации

Диссертация содержит оглавление, перечень условных обозначений, введение, общую характеристику работы, основную часть, представленную 6-тью главами, заключение и список использованной литературы, включающий 378 источников. Работа изложена на 194 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и 8 таблиц.