Введение к работе
Актуальность проблемы. Важной проблемой экологической биофизики является изучение механизмов адаптации живых организмов к изменяющимся факторам внешней среды. Широкие адаптационные возможности растений обусловлены не только высокой пластичностью темпового метаболизма, но и способностью регулировать такой жизненно важный для растительных организмов процесс, как фотосинтез. К настоящему времени достигнуты существенные успехи в исследовании молекулярных механизмов первичных реакций фотосинтеза и структурной организации тилакоидных мембран в хлоропластах, обеспечивающих высокую эффективность первичных реакций фотосинтеза. Долгое время существовала точка зрения, согласно которой регуляция этих процессов со стороны целого растения не является необходимой в оптимальных условиях. Однако, тот факт, что в первичных процессах фотосинтеза, особенно при повышенной интенсивности света, образуются сильные восстановители и окислители, избыток которых может вызвать деструктивные процессы в клеточных мембранах и органеллах, указывает на необходимость согласования в клетке скоростей образования и расходования этих продуктов. В свою очередь это предполагает наличие специальных механизмов регуляции первичных процессов фотосинтеза в нормальных физиологических условиях.
Как правило, при изучении механизмов регуляции первичных реакций фотосинтеза основное внимание уделялось исследованию тех факторов внешней среды, которые прямо влияют на фотссингетический аппарат. В частности, при изменении интенсивности или спектрального состава света регуляция осуществляется путем структурной перестройки тилакоидных мембран, а также изменения состава и соотношения светособирающих и электрон-транспортных комплексов, т.е. за счет
биосинтеза структурных белков. Вместе с тем, целый ряд экспериментальных данных (Семсненко, 1978; Vcnediktov, 1989; Кренделева, 1994) показывает, что (пруктурно-функциональная организация фотосинтетических мембран находится под контролем продуктов клеточного метаболизма. Необходимость метаболитного контроля первичных процессов фотосинтеза обусловлена тем, что потребности клетки в продуктах фотосинтеза в значительной степени зависят от ее физиологического состояния, изменяющегося как в процессе роста и развития растений, так и под действием внешних факторов. Молекулярные механизмы такого рода эндогенной метаболитной регуляции активности фотосинтетических мембран и электрон-транспортных комплексов изучены недостаточно.
Изучение внутриклеточных механизмов, лежащих в основе метаболитной регуляции активности фотсчзштетяческих мембран, имеет существенное значение для понимания фотосинтеза как важнейшего физиологического процесса, а также расширяет возможности целенаправленного воздействия на фотосинтетические реакции при создании промышленных биотехнологических систем.
Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заключалась в изучении природы внутриклеточных регуляторных механизмов, обеспечивающих адаптационную перестройку структурной и функциональной организации тилакоидных мембран хлоропластов при изменениях скорости и направленности темнового метаболизма одноклеточных водорослей. Потребности темнового метаболизма клетки в продуктах световых реакций фотосинтеза изменяются не только под воздействием внешних факторов, но и при постоянных условиях роста в процессе развития клетки. В связи с этим в конкретные экспериментальные задачи входило:
- исследовать эндогенную регуляцию формирования фотосинтетического аппарата одноклеточной зеленой водоросли хлореллы в течение цикла деления клеток;
- для выявлении взаимосвязи между темновым метаболизмом клетки и активностью первичных процессов фотосинтеза изучить изменения состояния фотосинтетического аппарата при внешних воздействиях, влияющих на скорость и направленность темпового метаболизма растительной клетки (обеспеченность минеральным питанием, гетеротрофные условия роста, тепловой шок);
- выявить и изучить процессы, лежащие в основе механизмов метаболитного контроля фотосинтетической активности клетки.
Научная новизна. В результате изучения формирования фотосинтетического аппарата в синхронной культуре хлореллы, установлено, что регуляция активности мембран хлоропластов, направленная на оптимизацию энергообеспечения процессов роста и воспроизведения клетки в се онтогенезе, основана на однократном, поочередном синтезе и включении отдельных энертопреобразующих комплексов в тилзкоиднуго мембрану на различных стадиях клеточного цикла.
Впервые экспериментально доказано наличие эндогенной регуляции активности первичных реакций фотосинтеза в клетках хлореллы, а также выявлен один из механизмов метаболитного контроля структурно-функциональной организации фото-синтетического аппарата, связанный с активацией хлоропластного дыхания.
Впервые показано, что обратимая инактивация реакционных центров фотосистемы II, предшествующая разборке фотосинтетического аппарата при лимитировании скорости роста водоросли минеральным питанием, носит адаптационный характер. Аналогичная инактивация, приводящая к накоплению РЦ ФС II, неспособных к фотохимическому тушегапо энергии возбуждения антенны, обнаружена и при гетеротрофном росте водоросли. Этот факт, а также результаты исследования влияния ингибиторов фотосинтеза и гликолиза на активность ФС П, позволили установить,
что инактивация фотосистемы її инициируется накоплением в хлоропласте продуктов углеводной природы. Она является проявлением действия механизма метаболитной регуляции, направленной на согласование скорости образования продуктов световых реакций фотосинтеза с энергетическими потребностями клеточного метаболизма.
Впервые в целых клетках водоросли показано, что ускорение синтеза углеводных метаболитов при дефиците азота сопровождается увеличением вклада циклического транспорта электронов в энергизацию мембран тилакоидов.
Обнаружено, что при действии теплового шока в отсутствие освещения инактивация ФС Л обусловлена двумя процессами. Первый связан с изменением темновато метаболизма клетки и инициируется появлением в хлоропласте промежуточных продуктов углеводного метаболизма при температурнозависимом ускорении распада запасных углеводов. В результате этого процесса РЦ ФС П теряют способность к фотохимическому тушению энергии возбуждения, также как это наблюдается при дефиците минерального питания или гетеротрофном росте. Второй процесс отражает необратимую деструкцию ФС П при повышенных температурах, приводящую к усилению безизлучательной диссипации энергии возбуждения в реакционных центрах.
Впервые обнаружено, что центральную роль в механизме метаболитной регуляции активности ФС її играет активация хлоропластного дыхания, т.е. усиление потока электронов от НАД(Ф)Н на кислород через пластохинон при накоплении в хлоропласте продуктов углеводного метаболизма. Взаимодействие восстановленного пластохинона с первичным хинонным акцептором (Qa) приводит к инактивации ФС її, связанной с потерей способности РЦ ФС її к фотохимическому тушению энергии возбуждения антенны.
Научная и практическая значимость работы. Установленные в работе закономерности регуляции активности и состава тилакоидных мембран в зависимости от изменения физиологического состояния клеток водоросли раскрывают картину взаимодействия первичных процессов фотосинтеза с процессами метаболизма в целой клетке. Эти закономерности позволяют провести углубленный анализ природы молекулярных механизмов метаболитной регуляции первичных процессов фотосинтеза. Полученные экспериментальные результаты и обобщения вносят существенный вклад в исследование механизмов адаптации и устойчивости фотссинтезирующих организмов к условиям среды обитания.
Выявленные закономерности в реакции фстосинтетического аппарата на внешние воздействия использованы для разработки методов диагностики состояния фоггосинтетического аппарата растений и природного фитопланктона, а также для выявления его повреждений под действием неблагоприятных факторов среды и при антропогенных воздействиях. Полученные результаты могут быть использованы при разработке методов оптимизации и управления биосинтезом микроводорослей при использовании их в качестве продуцентов ряда ценных метаболитов в промышленных масштабах.
Ряд научных положений, обоснованных в работе, используется в курсах лекций и практикумах по биофизике для студентов и аспирантов кафедры биофизики Биологического факультета МГУ.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Ш Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений, Алма-Ата, 1974; Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; Международной конференции по биоконверсии солнечной энергии, Пущино, 1983; Всесоюзном совещании по лимнологии горных водоемов, Севан, 1984; Всесоюзной конференции по изменчивости пигментного аппарата и направленности первичных процессов фотосинтеза в зависимости от
факторов среды, Чернигов, 1985; V Всесоюзном биохимическом съезде, Киев, 1986; Всесоюзной конференции по первичным процессам фотосинтеза и механизмам их регуляции, Ужгород, 1988; I Всесоюзном съезде физиологов растений, Минск, 1990; Конференции стран СНГ по структурно функциональной организации фотосинтетических мембран и их моделей, Пушино, 1993; XI Международном биофизическом конгрессе, Будапешт, 1993; Ежегодном симпозиуме ОФР "Физико-химические основы физиологии растений", Пенза, 1996; Международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза", Пущино, 1996.
Основные результаты доложены и обсуждены на специализированном научном семинаре в Московском государственном университете.
Объект и метопы исследования. Одноклеточные водоросли обладают уникальной способностью изменять направленность метаболизма при различных воздействиях. Данная особенность, наряду с легко реализуемой, по сравнению с высшими растениями, возможностью культивирования микроводорослей в полностью контролируемых условиях, делает их удобной модельной системой для изучения проблем адаптации и эндогенной регуляции фотосинтетического аппарата. Основные закономерности внутриклеточной регуляции фсахняштетических процессов у одноклеточных водорослей, могут быть спроецированы, с учетом надклеючных уровней регуляции, и на изменение активности первичных реакций фотосинтеза в хлоропластах высших растений. Это определило выбор в качестве основного объекта исследования одноклеточной зеленой водоросли Chlcnrella pyrenoidosa.
Для изучения роста водорослей в строго контролируемых условиях выращивания был разработан и сконструирован оригинальный культиватор, снабженный рядом проточных датчиков и програмируемым упрагэтяющим устройством. Данная система
позволяла вести непрерывный контроль за условиями культишфования и автоматически, каждые 30 мин, регистрировать изменения состояния фотосинтетичесасого аппарата целых клеток хлореллы непосредственно в условиях культивирования путем измерения миллисекундной и долгоживущей замедлеішой флуоресценции хлорофилла (ЗФ). Эндогенную регуляцию состояния фотосинтетического аппарата исследовали в синхронной культуре хлореллы, которую получали методом чередования световых и темновых периодов культивирования. В полученной таким образом синхронной культуре разброс клеток по возрастам, измеряемый по продолжительности периода увеличения числа клеток, составлял 2,5 часа и соответствовал продолжительности периода возрастания числа многоядерных клеток в середине цикла развития водоросли.
При исследовании влияния дефицита минерального литания культуру хлореллы, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, отмывали центрифугированием от минеральной среды Тамия зі помещали на ту же среду, не содержащую азота или фосфора.
Гетеротрофные условия роста создавали путем переноса выращенной на свету культуры в темноту и внесения в минеральную среду 0,5% глюкозы.
Хлоропластное дыхание измеряли по амплитуде медленного амперметрического сигнала после освещения короткой вспышкой света насыщающей интенсивности адаптированных к темноте клеток водоросли, находяїцихся на поверхности открытого платинового электрода. Увеличение концентрация кислорода вблизи электрода в этом случае связано не с феггосинтетическим выделением кислорода, а с обратимым подавлением хлоропластного дыхания за счет фоюиндуцированного оттока электронов из дыхательной в фстосинтетическую электрон-транспортную цепь через с>бщий для двух цепей пул пластохинона (Peltier, 1987).
Кроме того, для характеристики состава и функциональной активности фотосинтетического аппарата использовали широкий набор спектральных и спектрально-динамических методов: абсорбционная, флуоресцентная, производная и дифференциальная спектроскопия, поляризационная флуоресценция, пикосекундная импульсная флуоресцентная спектроскопия. Были использованы методы измерения переменной флуоресценции, методы ЭПР и полярографический метод определения кислородного обмена при импульсным и постоянном освещении клеток.