Механизмы внутриклеточной сигнализации в перитонеальных макрофагах Крутецкая, Зоя Иринарховна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Одной из важнейших и актуальных проблем современной биофизики и биологии клетки является выяснение механизмов внутриклеточной сигнализации. Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и большую практическую значимость, так как действие многих токсинов и фармакологических агентов направлено именно на компоненты систем внутриклеточной передачи сигналов.

В настоящее время установлено, что весьма важным моментом внутриклеточной передачи сигналов является изменение транспорта и внутриклеточной концентрации различных ионов. Доказано, что изменение внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺, Na⁺, К⁺, Н*, СГ играет существенную роль в процессах активации и регуляции различных эбщих и специализированных клеточных функций.

Одной из основных систем, приводящих к изменению внутриклеточной концентрации юнов, являются селективные ионные каналы биомембран. Классики биофизики ионных каналов Бертил Хилле и Клэй Армстронг предлагают выделять три исторических периода г изучении ионных каналов (три периода «канатологии») (Hille, 1992). «Героический іериод» (heroic age) начинается с выдающихся экспериментов Коула и других на игантских аксонах кальмара и каракатицы и заканчивается формулировкой теории ^оджкина и Хаксли (Hodgkin, Huxley, 1952). В последующий "переходный период" transitional era) "каналологии" модель Ходжкина-Хаксли с небольшими модификациями 5ыла использована для описания свойств воротных механизмов потенциал-зависимых гонных каналов многих возбудимых образований. Шло накопление биофизических инных о характеристиках ионных каналов. В "переходный период" основным жспериментальным подходом был метод фиксации потенциала, который в течение более 15 лет являлся наиболее адекватным биофизическим методом исследования ионных ;аналов. Более того, в это время были открыты фармакологические агенты как інструмента исследования ионных каналов. В этот период нами были выполнены гионерские работы по фармакологическому разделению и идентификации компонент симметричного тока смещения или воротного тока Ыа⁺-каналов в мембране перехвата 'анвье лягушки. С использованием токсина из яда среднеазиатского скорпиона Buthus upeus и алкалоида аконитина было установлено, что быстрая компонента воротных оков связана, по-видимому, с активацией Ма⁺-каналов, а медленная компонента токов мещения отражает смещение зарядов, связанное, очевидно, с процессом натриевой інактивации (Лонский и др., 1975, 1976; Крутецкая и др., 1977,1978 а, б; Можаева и др., 977). С помощью агентов, специфически влияющих на процесс натриевой инактивации, роведен фармакологический анализ кинетики инактивации макроскопических Ыа⁺-токов

мембране перехвата Ранвье. Использование противовоспалительного агента ифлумовой кислоты и специфического белкового реагента N-бромацетамида позволило ыдвинуть предположение о наличии в мембране нервного волокна гомогенной опуляции Ыа⁺-каналов, имеющих три состояния инактивационной системы (Лонский, :рутецкая и др., 1982, 1986, 1987,1989 а, б; 1990 а, б; 1991; Крутецкая и др., 1984, 1987).

"Современный этап" ("modern age») в изучении ионных каналов ознаменовался ведением двух новых методов исследования: метода локальной фиксации потенциала patch clamp method) и методов молекулярного клонирования мембранных белков. Метод окальной фиксации потенциала на микрофрагменте клеточной мембраны (Hamill et al., 981), позволяющий регистрировать токи одиночных ионных каналов, оказал такое же еволюционное влияние на современную электрофизиологию и биофизику, как и веденный более 45 лет назад метод фиксации мембранного потенциала. С помощью етода пэтч-клэмп в конфигурации "whole-cell" нами исследованы функциональные

характеристики и механизмы регуляции активности потенциал-зависимых К⁺-каналов выходящего выпрямления в мембране перитонеальных макрофагов крысы. Показано, что активность этих канатов модулируется арахидоновой кислотой и другими свободными жирными кислотами (Krutetskaya et al., 1994, 1995; Крутецкая и др., 1995 а, б, в; 1996 а; Крутецкая, Лебедев, 1998 а), а также тирозинкиназами и тирозинфосфатазами (Крутецкая, Лебедев, 1998 а).

Одной из важнейших задач современного этапа исследования ионных каналов является изучение механизмов регуляции активности каналов различными системами вторичных посредников и выяснение роли каналов в процесссах внутриклеточной сигнализации.

В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Са²⁺ (Berridge, Irvine, 1989; Berridge, 1990; см. обз. Крутецкая, Лебедев, 1992 a; Berridge, 1993; Clapham, 1995 a, b; Bootman et al., 1997). Изменения в транспорте и внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺ играют ключевую роль в запуске и регуляции общих и специализированных клеточных функций, таких как пролиферация, рост, секреция, сокращение, передача нервного импульса, иммунный ответ и т.д. (Berridge, 1995 b; Berridge, 1997 a, b; Berridge et al., 1998). Ca²⁺ является универсальным вторичным мессенджером, действующим в клетках бактерий, растений и животных. Качественный скачок в изучении механизмов Са²⁺-сигнализации в клетках произошел после разработки и введения в широкую практику высокочувствительных флуоресцентных зондов, позволяющих измерять внутриклеточную концентрацию Са²⁺ (Tsien et al., 1984; Grynkiewicz et al., 1985).

Практически все агонисты, связываясь с мембранными рецепторами, вызывают двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации Са²⁺, ГСа²⁺];, в клетках. В качестве первой фазы выступает кратковременная мобилизация Са из внутриклеточных депо. Вторая фаза, более длительная, связана с входом Са²⁺ из наружной среды. В возбудимых клетках вход Са²⁺ осуществляется по потенциалзависимым Са²⁺-каналам. В то же время пути входа Са²⁺ в невозбудимые клетки изучены значительно меньше. В настоящее время предполагают, что одним из основных механизмов входа Са²⁺ в электрически невозбудимые клетки является так называемый депо-зависимый или "емкостной" вход Са²⁺. В соответствии с моделью "емкостного" входа Са²⁺ (Putney, 1990; Berridge, 1995 а), вход Са²⁺ регулируется степенью заполнения Са-депо таким образом, что опустошение депо активирует вход Са²⁺. В то же время, механизм, посредством которого мобилизация Са²⁺ из депо регулирует вход Са²⁺, а также молекулярная природа депо-зависимых Са²⁺-каналов остаются неясными.

В отличие от многих других мессенджеров, Са²⁺ необходим для жизнедеятельности клеток, и в то же время длительное повышение [Са²*]; приводит к гибели клеток. Образно говоря, ионы Са²⁺ являются сигналом для жизни и смерти клетки (life and death signal) (Berridge et al., 1998). Эта противоречивая роль Ca²⁺ в клетке, как мессенджера или токсина, на протяжении многих лет интересует исследователей.

Фагоцитирующие клетки (макрофаги, нейтрофилы) отвечают на воздействие разнообразных агонистов, быстро гидролизуя мембранные фосфолипиды, что приводит к генерации большого числа внутриклеточных и экстраклеточных мессенджеров. Одним из наиболее ранних событий, запускаемых в этих клетках при воспалительных реакциях, является активация сигнальных путей с участием фосфоинозитид-специфической фосфолипазы С и фосфолипазы А₂, что играет ключевую роль в запуске или модуляции хемотаксиса, секреции, фагоцитоза, образования супероксидов (Snyderman, Uhing, 1992).

В связи с этим, представлялось целесообразным исследовать механизмы внутриклеточной сигнализации в таком удобном объекте как перитонеальные макрофаги крысы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении механизмов генерации и регуляции Са²⁺-сигналов и в первую очередь входа Са²⁺ в перитонеальных макрофагах при их активации пуринергическими агонистами (АТФ, УТФ) и ингибиторами эндоплазматаческих Са²⁺-АТФаз (тапсигаргин, циклопьязониковая кислота). Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. С использованием широкого спектра фармакологических агентов, влияющих на функционирование сигнальных систем, выяснить роль и взаимосвязь известных систем вторичных посредников, таких как фосфоинозитидная, адеиилатциклазная, гуанилатциклазная, тирозинкиназная системы, каскад метаболизма арахидоновой кислоты в регуляции формирования Са²⁺-сигналов в макрофагах.

2. Исследовать фармакологические характеристики входа Ca^2f в макрофаги.

3. Определить возможную роль энергетического метаболизма макрофагов в регуляции Са²⁺-сигналов.

4. Установить роль структур цитоскелета в формировании Са²⁺-ответов в макрофагах.

Научная новизна работы. Впервые проведено широкое комплексное исследование механизмов внутриклеточной сигнализации в перитонеальных макрофагах крысы. Следует отметить, что все результаты о сложной, множественной регуляции Са²⁺-сигналов различными жизненноважными для клетки функциональными системами для данного объекта получены впервые.

С помощью широкого арсенала фармакологических агентов, влияющих на компоненты систем внутриклеточной сигнализации, выявлена важная роль всех известных систем вторичных посредников и других ключевых функциональных систем клетки в регуляции формирования Са²⁺-сигналов в макрофагах.

Впервые во всех сериях экспериментов по изучению модуляции Са²⁺-сигналов и прежде всего депо-зависимого входа Са²⁺ использованы два методических подхода -исследование клеток в нормальной физиологической и бескальциевой среде инкубации.

Впервые показана важная роль тирозинкиназ и тирозинфосфатаз в регуляции входа Са²⁺ в макрофаги. Анатиз полученных данных позволяет сделать вывод, что важнейшую роль в поддержании внутриклеточного Са^-гомеостаза как в покоящихся клетках, так и при действии агонистов, играет динамический баланс между активностью тирозинкиназ и тирозинфосфатаз.

Проведен максимально широкий ингибиторный анализ роли различных продуктов метаболизма арахидоновой кислоты, а также свободных арахидоновой и других жирных кислот в формировании Са²⁺-сигналов в макрофагах.

Впервые показана важная роль микротрубочек и микрофиламентов в активации и регуляции депо-зависимого входа Са²⁺ в клетки, а также в формировании Са²⁺-сигналов, вызываемых ингибитором тирозинфосфатаз фениларзиноксидом.

Анализ всех полученных данных приводит к выводу, -что вход Са²⁺ чрезвычайно чувствителен к малейшим изменениям в состоянии различных систем клетки, что способствует предотвращению массированного входа Са²⁺ в клетки и их возможной гибели.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования механизмов генерации и регуляции Са²⁺-сигналов в макрофагах вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы биофизики и биологии клетки - проблемы внутриклеточной передачи сигналов.

Обобщения результатов работы существенно расширяют представления о механизмах Са²⁺-сигнализащш в клетках при их рецептор-зависимой активации, о взаимосвязи, взаимодействии и взаимовлиянии в этих процессах различных систем вторичных посредников и могут быть использованы в исследованиях механизмов управления функциональными процессами, в которых в качестве основного вторичного посредника выступают ионы Са²⁺.

Полученные в работе новые данные о механизме действия фармакологических агентов, влияющих на системы внутриклеточной сигнализации в макрофагах, имеют не только теоретическое, но и большое практическое значение для медицины и фармакологии. Данные фармакологического анализа могут быть использованы для скрининга новых эффективных лекарственных средств.

Разработанные и примененные в диссертации методы, а также результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре биофизики Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на: 1 Всесоюзном Биофизическом Съезде (Москва, 1982), Республиканской научной конференции "Синтез и изучение физиологически активных веществ" (Вильнюс, 1984), на П Республиканской конференции "Проблемы экологической биофизики" (Тбилиси, 1986), V Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), VI Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биологические мембраны в норме и патологии" (Тбилиси, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Ионные каналы в биологических мембранах" (Кара-Дат, 1990), Внутривузовской конференции "Доминантные механизмы поведенческих адаптации" (Ленинград, 1990), Международном симпозиуме "Механизмы Са²⁺ гомеостаза в возбудимых клетках" (Киев, 1993), Съезде Физиологического общества при РАН (Пущино-на-Оке, 1993), симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994), IV EBR.0 Международном конгрессе по нейронаукам (Киото, Япония, 1995), I (XI) Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996), ХХХШ Международном конгрессе по физиологическим наукам (Санкт-Петербург, 1997), I и II Международных симпозиумах "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995, 1998), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино-на Оке, 1998), XVII Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), IV Совещании по тирозиновому фосфорилированию и клеточной сигнализации (Ла Джолла, Калифорния, 1998), пленарном заседании Санкт-Петербургского общества естествоиспытателей (Санкт-Петербург, 1999), ПІ Совещании по тирозиновому фосфорилированию и клеточной сигнализации (Cold Spring Harbor Laboratory, 1999), V IBRO Международном конгрессе по нейронаукам (Иерусалим, Израиль, 1999), П Съезде Биофизиков России (Москва, 1999).

По материалам диссертационной работы были также прочитаны лекции в Тель-Авивском университете (Тель-Авив, Израиль, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 49 научных работ в отечественной и зарубежной печати, в том числе 1 монография, 5 заказных обзорных статей и 2 учебно-методических пособия.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 458 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, десяти разделов экспериментальной работы (каждый из которых содержит небольшую литературную предпосылку, результаты исследования и их обсуждение), общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 898 наименований. Работа иллюстрирована 127 рисунками.