Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время все большее внимание привлекает изучение молекулярных механизмов запуска и регуляции физиологических процессов в клетках. Активация определенных физиологических процессов в клетках в основном осуществляется благодаря взаимодействию природного стимула (гормоны, факторы роста, медиаторы, митогены и другие факторы) с рецептором на плазматической мембране клеток, в которой находятся функциональные системы, преобразующие внешние сигналы во внутриклеточные. Внутриклеточные сигналы передаются молекулами-посредниками или "вторичными мессендкерами".
Важную роль в трансмембранной передаче сигнала играют изменения в транспорто и внутриклеточной концентрации ионов и В первую очередь ИОНОВ Са ( Rasmussen.jiarret, 1984; Berridpe, Irvine, 1989( Hughes,Putney, 1990; Крутецкая, Лебедев, 1992a), а такие H+, Na+ , К"1", роли которых в последнее время удаляется большое внимание (Веренинов, Марахова, 1986; Grinstein е а 1989).
В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Са ( Rasmussen.iiarret t 1984; jierridr;e, Irvine, 1989). Изменения в транспорте и внутриклеточной концентрации ионов Са играют ключевую роль в запуске и регуляции o6qnx и специализированных клеточных функций, таких как пролиферация, рост, секреция, сокращение, передача нервного импульса, иммунный ответ и т.д.
Как выяснилось в последнее время, зкстраклеточные адени-новые нуклеотиды могут являться одним из регуляторов функционального состояния различных клеток и тканей ( Gordon, 1986). AM или АДФ, действуя снаружи в микромолярных концентрациях, взаимодействуют со специальными рецепторами клеток - "пурино-рецепторами" ( Bumstock, 1978) и могут влиять на многие биологические процессы в различных клетках.
Клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) имеют на своей поверхности пуринорецепторы Р2и-типа, которые» активируются экзогенной ATS и приводят к стимуляции эффекторной молекулы -фосфолипазы С, которая расщепляет мембранный фосфолипид фосфа-тидилинозитол-4,5-бифосфат на два внутриклеточных мессенджера-водорастворимый инозитол-1,4,5-трифосфат и липидорастворимнй ДиацилГЛИцерол ( їоипр, 1985; Dub.yak, 1986; Wiener ".R.
1986). Инозитолтрифосфат мобилизует ионы Са из эндоплазма-тического ретикулума, увеличивая концентрацию свободных ионов Са + в цитозоле, а диацилглицерол, оставаясь в мембране, активирует Са -чувствительную, фосфолипидзависимую протеинки-назу С. Обнаружено, что многие другие типы клеток также активируются АТФ по фосфоинозитиэюму пути, поэтому клетки АКЭ являются удобным объектом для изучения механизмов трансмембранной передачи сигнала от ATQ-рецептора.
Поддержание кальциевого гомеостаза - тонкий, сложный и хорошо отрегулированный процесс, в котором принимают участие многочисленные Са -транспортирующие системы, расположенные в различных мембранах клетки ( Carafoii, 1967). Стимуляция многих рецепторов приводит к двухфазному увеличению внутриклеточной концентрации ионов Са вследствие мобилизации Са из внутриклеточных депо и входа Са по градиенту концентрации из наружной среды. Учитывая большой градиент концентрации ионов Са между внешней средой и цитозолем и то, что массированный вход Са + в клетки может представлять опасность для их функционирования, можно было предположить, что системы входа ионов Са должны очень жестко регулироваться.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в дальнейшем изучении механизмов формирования кальциевого сигнала при активации клеток АКЭ экстраклеточной АТФ и путей регуляции рецептор-зависимого входа Са в эти клетки. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Рассмотреть роль различных Сег+-транспортирующих систем клетки в формировании кальциевого сигнала.
-
Определить возможную взаимосвязь изменений транспорта кальция и других ионов <Н+, Na+ , +) при рецептор-зависимой активации клеток.
-
Исследовать зависимость кальциевого сигнала от температуры и активности систем окислительного метаболизма.
-
Определить зависимость кальциевого сигнала от уровня содержания циклических нуклаотидов и активности протеинкииаэы С.
-
Изучить роль арахидоновой кислоты и ее продуктов в регуляции механизмов формирования кальциевого сигнала.
Научная новизна. Впервые показано, что в формировании
кальциевого сигнала при рецептор-зависимой активации клеток, кроме процессов мобилизации ионов Са*"* из внутриклеточных депо и входа их снаружи, участвует механизм активного выброса Са во внеклеточное пространство с помощью АТФазы плазматической мембраны, что является причиной быстрого снижения Са + в первые минуты после активации клеток.
Доказана взаимосвязь входа ионов Са + в клетки и активности Па+/н+-обмена клеток АКЭ при их рецептор-зависимой активации.
Показана сложная множественная регуляция рецептор-зависимого входа ионов Са в клетки АКЭ, состоящая в зависимости этого процесса от температуры, энергетического метаболизма клетки, концентрации цАМЗ, активности протеинкиназы С, а также продуктов липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты.
Научно-практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах форшрования кальциевого сигнала в клетках при их рецептор-зависимой активации, о взаимосвязи в этом процессе транспорта различных ионов и могут быть использованы в исследованиях механизмов управления различными функциональными процессами, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Са . Использованное сочетание методов изучения ионтранспоргных систем может быть применено для выяснения механизмов действия и побочных эффектов различных фармакологических препаратов.
Апробация работы. Результаты диссзртационной работы были доложены на 5 Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, І9Б8), на Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на зф-фекторные клетки" (Суздаль, 1989), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1969), на конференции <ШЛ им.А.А.Ухтомского "доминантные механизмы поведенческих адаптации" (Ленинград, 1990), на Всесоюзном совещании "Ионный транспорт и регуляция функций клеток" (Ленинград, 1990), на Всесооэном совещании "Внутриклеточная сигнализация" (Москва, 1991), на Международной шкоде "Механизмы (кг+ гомеостаэа в возбудимых клетках" (Киев, 1993).
Структура и объем диссертации, диссертация состоит из