Введение к работе
Актуальность проблемы. Все известные в настоящее время эпителиальные ткани являются барьером, отделяющим внутреннюю среду живых организмов (кровь, гемолимфа, интерстициальная жидкость) от внешней среды и, как правило, активно, с затратами энергии участвуют в системе гомеостаза организма, для поддержания которого активно транспортируют ионы из внешней среды в кровь (сорбирующие эпителии или в обратном направлении (секретирующие эпителии). В связи с тем, что система гомеостаза отслеживает обычно сразу несколько концентраций ионов, актуальным является изучение механизмов регуляции и энергообеспечения ионных насосов эпителиальных тканей, тем более, что нарушения в их работе могут привести к серьезной патологии организма и даже к его гибели.В настоящее время предложен ряд фармакологических препаратов (ами-лорид, фуросемид, этакриновая кислота, уабаин, их производные и т.п.), которые позволяют корректировать некоторые нарушения в системе гомеостаза. С другой стороны, слабо изучено взаимодействие механизмов регуляции и энергообеспечения ионных насосов эпителиальных такней с эндогенными регуляторами и субстратами ферментативных реакций, в том числе их взаимодействие с АТФ и ее производными.
Как показано в настоящей работе на примере эпителиев, представляющих основные 'морфологические (одно- и многослойные) и функциональные (сорбирующие и секретирующие) типы эпителиальных тканей, АТФ и ее производные активно взаимодействуют с системами трансэпителиального транспорта ионов, являясь аллостерическим регулятором, субстратом (в реакциях гидролиза) и продуктом (в реакциях синтеза АТФ) ферментов, осуществляющих трансэпителиальный транспорт ионов. Это взаимодействие весьма чувствительно к
S^rJSSHl^* тТИ^ЧиттЯМ I» иит'мЛнч'Ппям XT а V -ЯФАачи »*«.. ....т.. — —«— —
wwnusm.-. . ____,, і--- -— ,-- - , г' /-*—*-./»-* *"* «'"*
быми электрическими полями и сопряжено с трансэпителиальной миграцией АТФ.
Состояние вопроса, в литературе по биофизике, физиологии и биохимии эпителиев содержатся единичные работы, в которых исследовалось взаимодействие экзогенной АТФ с системой трансэпителиального транспорта натрия. Из 14 типов эпителия (рассмотренных в обзоре литературы диссертации) данные о таком взаимодействии приведены только для трех эпителиальных тканей: в тонком кишечнике лягушки и крысы АТФ стимулировала трансэпителиальный /абаин-чувствительный транспорт натрия (Kohn et al., 1967, 1970? Serencseer, Armstrong, 1971); эпителий слизистой желудка гид-
ролиэует экзогенную АТФ внешней и серозной поверхностям (Durbin, Kircher, 1975), причем этот гидролиз, по-видимому сопряжен с секрецией водорода (Kidder et al. , 1966) ; эпителиальные клетки проксимальных канальцев за 20 минут полностью поглощали АТФ из перфузата со стороны серозной поверхности (Shumpio et al., 1986).
Несмотря на небольшое число опубликованных фактов можно констатировать , что эффекты экзогенной АТФ не укладываются в существующие теоретические представления и не могут быть объяснены в рамках общепринятой в настоящее время "трансклеточной" гипотезы Функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия (Ussing, Windhager, I964J Ussing, 1982).
Так же не могут быть объяснены в рамках трансклеточной гипотезы и некоторые другие экспериментальные факты: 1) чистая сорбция натрия из очень разбавленных растворов (менее 0.1 ммоль/л), когда пассивный вход натрия в цитоплазму эпителиальных клеток кожи лягушки через апикальную мембрану невозможен (Krogh, 1937, 1938; Cereijido.Rotunno, 1967,. Moreno еt al. , 1973); 2) ничтожно малый транспортный фонд натрия в эпителии кожи лягушки, исключающий диффузию натрия через цитоплазму клеток (Zerahn, 1969; Acevs, Erlij, 1971; Dorge,Nagel , 1972; Moreno et al., 1973); 3) базолатеральная локализация Na ,K -АТФазы в секретирующих натрий эпителиях, исключающая ее участие в активной секреции натрия из'клетки через апикальные мембраны (Karnaky et al., 1971; Stirling, 1975; Ernst, 1975; Ernst, Mills, 1977; Silva et al., 1977; Mills, Dibona, 1980); 4) отсутствие обмена натрия, транспортируемого через эпителий желчного пузыря с внутриклеточным натрием (Hill, Hill, 1987); 5) угнетение трансэпителиального активного транспорта натрия через изолированную кожу лягушки флюороацетатом при неизменной концентрации натрия в цитоплазме эпителиальных клеток (Duncan et al., 1985) и т.п.
В связи с актуальностью как в теоретическом, так и в прикладном а,спекте правильного понимания функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов представляется принципиально важным дальнейшее изучение фактов, не укладывающихся в схему общепринятой трансклеточной гипотезы. Эти исследования открывают новое направление в изучении эпителиев, конечной целью которого является создание функциональной модели трансэпителиального транспорта ионов натрия адекватной всем имеющимся экспериментальным данным.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выяснении молекулярных механизмов взаимодействия экзогенной АТФ
с основными типами эпителиальных тканей (одно-,многослойных/сек-ретирующих-сорбирующих), основных реакций этого взаимодействия, условий обратимости и механизмов регулирования этих реакций. В этой связи в число основных задач исследования входило:
-
Изучение влияния экзогенной АТФ из растворов, омывающих внешнюю поверхность эпителия, на трансмембранный транспорт ионов натрия (ТКЗ), в том числе в присутствии ингибиторов ионного транспорта.
-
Выяснение возможности специфического гидролиза экзогенной АТФ уабаин-чувствительной Na ,К -АТФазой.
-
Выяснение условий обратимости реакции гидролиза АТФ, выяснение возможности синтеза АТФ на внешней поверхности эпителиальных тканей из АДФ и неорганического фосфата.
-
Выяснение возможности управления (регулирования) процессами гидролиза и синтеза АТФ внешней поверхностью эпителия трансэпителиальным электрохимическим градиентом.
-
Выяснение возможности трансэпителиальной миграции АТФ и определение фонда АТФ эпителиальных тканей.
Научная новизна работы. В итоге выполнения работы обнаружен ряд новых, неизвестных ранэе свойств эпителия , позволяющих существенно скорректировать представления о функциональной организации эпителиальных тканей. *
Впервые показано, что экзогенная АТФ из внешнего омывающего изолированную кожу лягушки раствора осуществляет регулирующее воздействие на систему трансэпителиального транспорта натрия, стимулирует этот транспорт (при концентрациях, превышающих 100
мкмоль/л) и уменьшает ингибируюкий эффект амилорида на ТКЗ в диа-
— 8 —1
пазоне концентраций 10 -10 моль/л, причем, степень стимулиро
вания ТКЗ и защитного эффекта от амилорида зависят от концентра
ции Q^Tir\^ttu2y ттмг«я ытт^та *т^ ^ —АТФ—CU '!1^Т""-Т I*—Пм1" "—ШЇІЛ * IjO
внешнем омывающем растворе.
Впервые показана способность внешней поверхности основных типов эпителиев (однослойных-многослойных/сорбирующих-секретирую-щих) к специфическому, уабаин-, амилорид-чувствительному гидролизу экзогенной АТФ внешней поверхностью эпителиев. Уабаин ингиби-ровал этот гидролиз при приложении со стороны серозной поверхности эпителия, амилорид - со стороны внешней (мукозной) поверхности. Интенсивность этого гидролиза у всех исследованных эпителиальных тканей была пропорциональна концентрации экзогенной АТФ и изменялась в зависимости от концентраций основных лигандов Na ,К -АТФазы в омывающих растворах, управлялась (регулировалась) как
трансэпителиальными электрохимическими (по калию и натрию) градиентами, так и слабыми (+50 мВ) электрическими полями.
Впервые на эпителиальных тканях показана обратимость реакции гидролиза АТФ (внешняя поверхность эпителия кожи и мочевого пузыря лягушки и кожи морской рыбы продемонстрировали способность к синтезу АТФ из АДФ и неорганического фосфата ) и определены некоторые условия обращения реакции Na ,К -АТФазы.
Впервые показана способность АТФ к трансэпителиальной миграции и к накоплению в эпителии изолированной кожи лягушки, определены составляющие фонда АТФ в этом эпителии.
На основании анализа собственных экспериментальных данных и обзора литературы по предмету исследования в главе "Обсуждение результатов" показаны противоречия "трансклеточной" гипотезы с полученными результатами и предложена оригинальная "одномембран-. ная" модель функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия.
Практическое значение работы. На основании результатов экспериментальных исследований показано, что одной из мишеней токсических, лекарственных и других веществ, апплицированных к внешней поверхности эпителиальных тканей являются цитоплазматические центры Na ,К -АТФазы, сохраняющие функциональную активность. Использование данных о функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия позволило обнаружить новое семейство гли-козидов (полигонатозидов), обладающих выраженной кардиотонической активностью, не ингибирующих Na ,К -АТФазу и ТКЗ через кожу лягушки и, по-видимому, как следствие, обладающих чрезвычайно малой токсичностью - терапевтический диапазон концентраций полигонатозидов достигает двух-трех порядков (Стригина и др., 1985).
Полученные в работе данные позволили предложить изолированные эпителии водных животных, в том числе морских рыб в качестве тест -объекта для выяснения механизмов токсического действия на живые организмы тяжелых металлов и других загрязнений антропогенной природы, растворенных в воде (Бессонов и др., 1988).
Данные о функциональной организации многослойных эпителиальных тканей позволили предложить оригинальные решения при выполнении хоздоговорных работ, в результате чего получено авторское свидетельство
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 12-м Всесоюзном съезде физиологов им. Павлова (Тбилиси, 1975) , на международном симпозиуме "Взаимодействие между водой и живым ве-
иеством" (Одесса, 1975) , I Всесоюзном биофизическом конгрессе (Москва, 1982), на Всесоюзном совещании по межведомственной программе "Ионный канал" (Каунас, 1983), на Выездной сессии межведомственного научно-технического Совета по биофизике (пос.Витязь, Владивосток, 1985) , на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1986), на международных симпозиумах СССР-ФРГ (Киев, 1983, 1987), на П Международном Тихоокеанском симпозиуме по морским наукам (Находка,1988), представлены на 6 Всесоюзной конференции "Физиология почек и водно-солевого обмена" (Новосибирск, 1981), на б международном биофизическом конгрессе (Киото, 1978) , на 8 международном биофизическом конгрессе (Бристоль, 1984), на международном симпозиуме "Транспорт воды и ионов через эпителии" (Париж, 1986). По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ.
Место проведения работы. Работа выполнялась на морской экспериментальной станции Тихоокеанского океанологического Института ДВО АН СССР "Витязь". Разделы, связанные с изотопными исследованиями, проведены в изотопной лаборатории МГУ (потоковые измерения
Na и Na) и изотопных лабораториях Института белка АН СССР и
Института биофизики АН СССР (измерения миграции АТФ и потоков неорганических фосфатов, а также включения метки неорганического фосфата в АТФ при изучении синтеза АТФ из АДФ и неорганических фосфатов). Автор благодарен за методическую помощь при измерении микроконцентраций АТФ В.А.Кратасюк и Г.Е.Бронникову; за помощь при выделении Na ,К -АТФазы и определении ее активности К.Н.Дкан-джугазян и О.М. Рожмановой . Автор считает также своим приятным долгом поблагодарить директора Тихоокеанского океанологического Института ДЮ АН СССР, академика В.И.Ильичева за содействие и поддержку в проведении работы; К.Н. Джанджугазян за обсуждение и критические замечания к главам, посвященным свойствам Na ,К -АТФазы, коллектив лаборатории физико-химической биологии ТОЙ ДВО АН СССР за помощь в проведении экспериментов, обработке и оформлении результатов.
Структура и объем диссертации. Рукопись состоит из введения, шести глав, заключения и выводов. В первой главе даны основные-определения элементов системы трансэпителиального транспорта ионов, приведено краткое описание морфологии различных типов эпи-телиев, подробно рассмотрены ограничения, накладываемые при использовании электрофизиологических и потоковых методов изучения эпителиев. Вторая_глава посвящена описанию объектов и методов исследований. В третьей и четвертой главах обобщены главным образом
литературные данные. В третьей главе обобщены данные о молекулярных механизмах системы трансэпителиального транспорта ионов. В четвертое главе приведено в виде краткого обзора сравнение основных свойств системы трансэпителиального транспорта ионов натрия у 14 наиболее изученных эпителиальных тканей. В пятой главе изложены собственные экспериментальные данные. В шестой_главе "Обсуждение результатов" приведен обзор существующих гипотез трансэпителиального транспорта ионов, предложена оригинальная "одномембранная" модель функциональной организации трансэпителиального транспорта ионов натрия, обсуждаются следующие из этой модели выводы и новые подходы к проблеме ионного натриевого канала эпителиальных тканей и стехиометрии гидролиза/синтеза АТФ
+ + Na ,К -АТФазой и трансэпителиального транспорта ионов натрия. За
шестой главой следуют з_аключе_ние и выводы к диссертации. Работа изложена на 390 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц, 60 рисунков. Список литературы содержит 705 названий работ отечественных и зарубежных авторов.