Механизмы повреждений эритроцитов Заводник, Илья Борисович

Введение к работе

Актуальность темы диссертации.

Плазматическая клеточная мембрана, занимающая особое место среди мембранных структур, выполняет ряд важнейших функций: барьерную, транспортную, обеспечивает контакт клетки с внешней средой, участвует в регуляции клеточного гомеостаза, определяет индивидуальность и целостность клетки. Состояние и устойчивость клеточной мембраны находятся в тесной взаимосвязи со свойствами компонентов цитоплазмы. Важнейшими направлениями современной биофизики мембран являются исследования механизмов повреждений плазматических мембран при различных воздействиях и изучение структурных элементов и взаимодействий, обеспечивающих оптимальную организацию клетки. Эти вопросы, привлекающие постоянное внимание исследователей, требуют своей дальнейшей углубленной разработки. В качестве объекта исследования молекулярных механизмов повреждений и устойчивости мембранных структур мы выбрали эритроциты человека, выполняющие в организме важнейшую функцию по транспорту дыхательных газов. Структурная организация, динамика, функции мембран эритроцитов (Конев, 1987, Lipowski, 1991, Isomaa et al., 1995, Рошупкин н еоавт., 1994) и закономерности различных типов гемолиза (Чертщкий и со-авт. 1991, Butler et al, 1992) исследованы достаточно детально. В то же время общие молекулярные механизмы повреждений эритроцитов остаются во многом невыяснены.

Нами изучены реакции эритроцитарной мембраны на повреждающее действие факторов различной природы. Одновременно были исследованы закономерности и механизмы реакций окисления и аутоокислепия оксигемоглобіни, поскольку до настоящего времени во многом неизвестна роль отдельных аминокислотных остатков молекулы белка, внешних эффекторов в регуляции реакций гемоглобина с кислородом и внешними окислителями. Аутоокисление гемоглобина представляет основной источник кислородных свободных радикалов в эритроците и во многом определяет устойчивость эритроцитов (Метелица, 1984, Falcioni, 1995).

Проведение данного исследования является необходимым этапом в расшифровке молекулярных механизмов функционирования плазмати-

Условные обозначения автореферата: ГДА - глутаровый альдегид, МДА -малоновый диальдегид, ТБПІ - t-бутилгидроперекись, ТБКРС - соединения, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, НЬ - гемоглобин.

2 ческих мембран эритроцитов. Проблема повреждений и устойчивости эритроцитов приобретает серьезное практическое значение в связи с участившимися случаями гемолитических состояний, связанных в том числе с неблагоприятным техногенным воздействием окружающей среды на организм человека.

Связь работы с крупными научными программами, темами.

Работа выполнена в рамках Республиканских комплексных программ фундаментальных исследований: "Исследование метаболических и регуляторних факторов, общеадаптационных и иммунных реакций, нейрохимических процессов в норме и патологии (Метаболический гомеостаз)", утвержденной постановлением Президиума АН БССР N 116 от 5.12.1990 г., и "Физико-химические механизмы функционирования биосистем как основа управления жизнедеятельностью растительных и животных оргашізмов (Функционирование биосистем)", утвержденной Дополнением 1 к постановлению Президиума АН Беларуси N 224 от 24 ноября 1995 г.

Цель и задачи исследования. .

Цель работы - выяснить молекулярные механизмы повреждений эритроцита и его компонентов при воздействии физиологически важных эффекторов и варьировании физико-химических параметров окружения.

Для достижения цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Определить критические структурные элементы эритроцитарных мембран, обеспечивающие их устойчивость к действию повреждающих факторов.

2. Изучить структурное состояние белков эритроцитарных мембран при изменениях рН, ионной силы, температуры, действии органических растворителей.

3. Изучить действие длинноцепочечных насыщенных жирных кислот и алифатических альдегидов на состояние липидного и белкового компонентов эритроцитарной мембраны.

4. Изучить закономерности окислительных повреждений мембран эритроцитов человека на примере действия органической гидроперекиси (t - бу-тилгидроперекись).

5. Оценить нарушения свойств мембран эритроцитов человека при патологиях, протекающих с окислительным стрессом (диабет).

6. Выяснить влияние на структуру и свойства мембран эритроцитов
ковалентной модификации альдегидными продуктами перешеного окисле
ния лилидов.

7. Исследовать механизмы, регулирующие взаимодействие гемоглобина с кислородом в реакции необратимого аутоокисления. Научная новизна полученных результатов.

Впервые предложена концепция существования в плазматических мембранах эритроцитов человека ряда критических структурных элементов, которые обеспечивают целостность эритроцита и в наибольшей степени изменяются при действии различных повреждающих факторов.

Установлено, что механический гемолиз связан с разрывом нескольких контактов между гетеродимерами спектрина. Основной причиной лизиса эритроцитов, индуцируемого высокими (2.2 - 5.5 М) концентрациями этанола, является преимущественное нарушение нативной структуры белка полосы 3. Повреждающий эффект этанола на эритроцитарную мембрану в значительной мере обусловлен уменьшением диэлектрической проницаемости среды. Показано, что свободные длишгоцепочечные жирные кислоты и алифатические альдегиды, уменьшая микровязкость бислойных и ашгулярных липидов, ингибируют мембранную ацетилхолигостеразу и не изменяют существенно термостабилыгость мембранных белков. Константа скорости реакции гемолиза, индуцируемого этими эффекторами, возрастала в ряду: метиловый эфир жирной кислоты -> жирная кислота -» алифатический альдегид. В формировании одной мембранной поры кооперативно участвуют 5 молекул эффектора (в случае пальмитиновой кислоты).

Установлено, что малоновый диальдегвд нарушает нативную структуру спектрина, повышает микровязкость и осмотическую прочность мембран эритроцитов. Алкилирование плазматических мембран ацетальдегидом (как показано нами для мембран гепатоцитов) существенно уменьшает число рецепторов простагландинов Еі и Е₂, не изменяя констант ассоциации с рецепторами.

Обнаружено, что индуцируемое экзогенной органической гидроперекисью окислительное повреждение эритроцитов, которое развивается по схеме: окисление внутриэритроцитарного глутатиоиа -> окисление оксиге-моглобина ~> перекисное окисление липидов, приводит к резкой гиперполяризации мембраны и бифазньш изменениям осмотической устойчивости эритроцитов.

Впервые показано, что мембранный потенциал и чувствительность к окислительному стрессу достоверно выше для эритроцитов пациентов, больных инсулинзависимой формой диабета.

Получены доказательства того, что реакция необратимого аутоокисления гемоглобина включает протонирование дистального гистидина молекулы белка и сольватацию порфиринового кольца гемоглобина водой. AMP,

4 АДР, ATP, лиридоксаль-5-фосфат не изменяют значение энтальпии процесса оксигенацин, незначительно уменьшают коэффициеит Бора, увеличивают динамическую подвижность белковой глобулы гемоглобина.

Практическая значимость полученных результатов.

Установленные механизмы и закономерности процессов повреждения плазматических мембран эритроцитов расширяют существующие представления о биофизических основах функционирования мембранных структур, важны для понимания реакцій! клетки на различные по своей природе специфические и неспецифические воздействия. Полученные результаты могут быть использованы при разработке способов направленной коррекции и профилактики мембранных повреждений при развитии патологических состояний, экстракорпоральных процедурах, других терапевтических воздействиях.

Исследование механизмов клеточных повреждений является необходимым этапом и расшифровке последовательности событий, пршзодящих к лизису клеток в многочисленных ситуациях гемолитических анемий.

Экономическая значимость полученных результатов.

Полученные результаты могут найти применение при разработке способов стабилизации эритроцитов в трансфузиологии, при создании искусственных кровезаменителей и систем транспорта кислорода. Результаты позволяют разработать ряд простых и высокочувствительных методик оценки состояния и устойчивости эритроцитов при различных патологиях и терапевтических воздействиях. В работе предложен простой способ фотохимического синтеза [2,3- ¹⁴С] ацетоина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту*.

1. В плазматической мембране эритроцитов человека существует ряд критических структурных элементов и взаимодействий, нарушение которых приводит к разрушению мембраны и лизису клеток и которые в наибольшей степени изменяются при действии повреждающих факторов различной природы. Такими критическими элементами являются, например, контакты между спектриновыми гетеродимерами мембранного цитокаркаса (разрушение нескольких контактов служит причиной механического гемолиза); мембранный домен белка полосы 3 (его денатурация выступает основной причиной этанол - индуцируемого лизиса клеток).

2. Окислительные повреждения эритроцитов, индуцируемые экзогенной органической гидроперекисью, приводят к росту избирательной проницаемости плазматической мембраны для потенциалобразующих ионов и, как следствие, к гиперполяризации мембраны. Окислительные процессы лежат в

5 основе обнаруженного нами роста мембранного потенциала эритроцитов при диабете.

3) Аутоокисление оксигемоглобина человека протекает с участием Т -конформации молекулы белка, катализируется протонированием функциональной белковой группировки и включает гидратацию гема. Скорость процесса аугоокисления возрастает при модификации гемоглобина малоновым диальдегидом. Химическая модификация цистеипа 93 В - цепей гемоглобина облегчает процесс аугоокисления, но шігибирует окисление гемоглобина феррицианидом.

Личный вклад автора.

Автором определено направление, сформулированы задачи, выбраны объекты и методы исследования. Экспериментальный материал диссертационной работы получен при решающем участии автора. Обобщение и анализ результов проведены автором самостоятельно.

Апробация результатов диссертации.

Результаты работы были представлены и обсуждены более чем на 30 научных конференциях и симпозиумах, в том числе: I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), Ш Конгрессе Международного общества биохимических исследований алкоголизма (Хельсинки, 1986), V, VI и VII Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1984, 1988, 1991), Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988), V Международном конгрессе по токсикологии "Фундаментальные исследования в токсикологии" (Брайтон, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), 20 Конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Будапешт, 1990), Всесоюзном совещании "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990), 27 и 28 Ежегодных конференциях Европейской ассоциации исследований печени (Вена, 1992 и Париж, 1993), VI Конференции "Свободные радикалы: от фундаментальной науки к медицине" (Турин, 1992),,4 Международной конференции по лазерной спектроскопии (Юувасюоля, 1992), I и II Съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994, 1996), 2 и 3 Симпозиумах "Свободные радикалы в биологии и медицине" (Лодзь, 1994. 1996), IX съезде Польского биофизического общества (Лодзь, 1995), научных семинарах Института биохимии АН Беларуси, Института биофизики Университета в Лодзи, Института физики Политехнической Академии в Познани.

Опубликованность результатов.

Результаты диссертации представлены в 50 научных публикациях, из них 29 статей в научных журналах (9 из которых опубликованы в международных журналах), 2 статьи в сборниках трудов и 19 тезисов докладов конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 9 глав (6 глав - собственные исследования), заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 475 работ. Полный объем диссертации составляет 281 страницу, включая 92 иллюстрации и 7 таблиц.