Механизмы образования и разрушения метгемоглобиннитрита в растворе Стародубцева, Мария Николаевна

Введение к работе

Актуальность темы диссертации

Проблема воздействия на организм человека неорганических кислородсодержащих соединений азота (NOx-соединений: нитритов, нитратов, азотистой и азотной кислот, оксидов азота, пероксинитритов, пероксинит-ратов н др.) в настоящее время является актуальной. Уровень поступления ЖХ-соедннений в организм человеха в связи с расширением областей их использования и с увеличением степени загрязнения окружающей среды постоянно увеличивается (с питьевой водой, пищей, лекарствами, вдыхаемым воздухом). Чрезмерное накопление NOx-соединений в организме вызывает поражение органов и тканей, приводящее к нарушениям физиологических процессов. Для нашей страны ситуация усугубляется в связи с повышенным радиационным фоном. В экономически развитых странах интенсивно проводятся работы по нормированию поступления NOx-соединений в организм человека ограничению их содержания в продуктах питания, в питьевой воде, в воздухе больших городов. Решение этих задач осуществляется одновременно с изучением особенностей поступления, распределения и выведения NOx-соединений из организма человека, с изучением реакций 1\ІО,-соедішений с важнейшими биомолекулами тканей организма. Одной из причин нарушения здоровья человека является взаимодействие NOx-соединений с гемоглобином. Конечным продуктом многих реакций в организме человека при поступлении извне NOx-соединений являются нитрит-ионы. Нитрит-ионы взаимодействуют с гемоглобином с образованием различных форм гемоглобина, в том числе метгемоглобин-нитрнта - комплекса метгемоглобинз с нитрит-ионами. Метгемоглобин-нитрит (metHb-NOz) является малоизученной формой гемоглобина. Следует ожидать, что метгемоглооин-иктрит и нитрозипгемогаобин (HbNO), как и другие NOx-соединения, могут обладать высокой химической активностью. Все это делает актуальным изучение свойств метгемоглобин-нитрнта и степени его участия в различных процессах в организме человека.

Свпзь работы с крупными научными программами, темами Результаты, положенные в основу диссертационной работы, были получены в рамках Государственной программы «Биофизические механизмы регуляции неспецифических реакций иммунитета» {1946-1997 гг.. Л» госрегистрацин 19963652) и Государственной программы «Синергетика» Министерства образования Республики Беларусь на 1996--000 гг. (темы «Молекулярно-мембранные механизмы трансдукцни и процессинга сигнала в клетках иммунной системы--). Лг 838/09) кафедры биофизики физического факультета Белорусского государственного университета, а так-

же в рамках темы «Изучение механизмов действия физических и химических факторов на белки и форменные элементы крови» кафедры медицин-скоГ' и биолопіческой физики Гомельского государственного медицинского института (1994-1998 гг.).

Цель и задачи исследования

Целью работы является установление закономерностей образования и разрушения метгемоглобин-нигрита в водных растворах и в эритроцитах человека, а также влияния ультразвука на эти процессы.

В диссертации поставлены и.решены следующие основные задачи:

Установить закономерности образоьания и разрушения метгемогло-бин-нитрнта в процессе взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами в водных растворах. Провести теоретический анализ модели обратимого одноместного связывания нитрит-ионов с атомом железа субъединицы метгемоглобина, описывающей процесс взаимодействия метгемоглобина с нитрит-ионами в растворе, и проверить ее соответствие экспериментальным данным. Разработать методику определения концентраций различных форм гемоглобина, одновременно находящихся в растворе, по спектрам электронного поглощения при ограниченной информации о коэффициентах экетинкцни одной из форм гемоглобина.

Исследовать взаимодействие метгемоглобин-нитрита с пероксидом водорода (НтО;). в том числе с помощью хемилюминесценции (люминол-зависимой и спонтанной), с целью установления основных интермедиатоь процесса.

Определить возможность и установить закономерности образования метгемоглобин-нитрита в эритроцитах человека.

Выявить влияние ультразвука (УЗ) на процесс образования метгемоглобин-нигрита в водных растворах. Изучить изменения химической структуры нитрозилгемоглобина под действием УЗ в водных и водно-спиртовых растворах.

Объект и предмет исследования

Объектом исследования являлись гемоглобин, а также эритроциты человека. Предметом исследования являлись механизмы образования и разрушения метгемоглобин-иитрита пра взаимодействии гемоглобина в водных растворах и 8 эритроцитах с нитритгиоками.

Методология и методы проеедепиого исследования В работе использовались спектрофотометрнческие, хемидюминес-центные. флуоресцентные и химические методы анализа.

Научная новизна и значимость полученных результатов Впервые систематически исследованы процессы образования и разрушения малоизученной формы гемоглобина — метгемоглобин-нитрита. Установлено, что процесс взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами в водном растворе включает в себя обратимую и необратимые реакции. Показано, что метгемоглобин-нитрит является промежуточным продуктом процесса взаимодействия ферро-форм гемогдобина с нитрит-ионами, в результате которого разрушается химическая структура гемоглобина. Взаимодействие нитрит-иона с железом метгемоглобина с образованием метгемоглобин-нитрита является обратимым и удовлетворительно описывается моделью одноместного связывания. Выявлено образование белков с нарушенной структурой порфиринового кольца гема при взаимодействии гемоглобина с нитрит-ионами, метгемоглобин-нитрита с Н;СЪ, а также в водно-спиртовых растворах нитрозилгемоглобина под действием УЗ. Показано, что продуктом взаимодействия метгемоглобин-нитрита с Н2О2 и инициатором образования такого рода структур является пероксинитритная кислота. Установлено образование метгемоглобин-нитрита в эритроцитах человека при наличии в окружающей эритроцит среде нитрит-ионов. Показана взаимосвязь состояния эритроцита и нитрит-модифицированных форм гемоглобина (метгемоглобина и метгемоглобнн-китрита) при воздействии на эритроцит нитрит-ионов. Экспериментально показано образование в реакции нитрита натрия (NaNOj) с Н2О2 в водных растворах транс- и цис-форм пероксинитритной кислоты и ее возбужденного состояния. Выявлен си-кергический эффект совместного воздействия на водные раствори гемоглобина УЗ и нитрит-ионов. Установлено увеличение под действием УЗ скорости окисления железа (11) гемоглобина нитрит-ионами и константы равновесия реакции образования-распада метгемоглобин-нитрита. Показано уменьшение скорости денатурации белкового компонента гемоглобина э озвучиваемых водных растворах в присутствии нитрит-ионов.

Практическая значимость полученных результатов Практический интерес для научных работников и специалистов системы здравоохранения представляют выводы об образовании метгемоглобин-нитрита в эритроцитах и в оодных растворах при взаимодействии гемоглобина с нитрит-ионами в малых концентрациях, а также данные о взаимодействии этой формы гемоглобина с Н^О^, результатом которого является разрушение химической структуры гемоглобина- Учет еше одной формы гемоглобина позволяет с новых позиций рассматривать многие процессы, происходящие а эритроцитах. Выявленные закономерности образования и разрушения четгемоглобин-нитрнта могут быть использованы .ия управления процессами в растворах гемоглобина и в эритроцитах с

участием NOx-соединений. Результаты хемилюминесцентного исследования реакции нитрита натрия с Н₂О_г в водных растворах могут быть -использованы при разработке хемилюминесцентного метода определения изомерных форм пероксинитритной кислоты. Разработанная методика определения концентраций форм гемоглобина (АО, превращающихся по схеме А|-»А2«-*Аз, с одновременной оценкой неизвестного коэффициента экс-тинкции одной из форм гемоглобина может быть полезна при изучении малоисследованных форм гемоглобина. Обнаруженные закономерности взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионами в водных растворах и внутри эритроцитов, особенности химических свойств метгемоглобин-нитрита и совместного влияния на водные растворы гемоглобина нитритов и УЗ могут быть использованы медицинскими работниками при составлении рекомендаций по предотвращению и лечению отравлений нит-риг(нитраг)содержащими веществами, а также по использованию лекарств, включающих нитриты, оксиды азота и другие NO_x-соединения, в условиях воздействия на человека УЗ и ионизирующего излучения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Гемоглобин (ферро-форма) в процессе его взаимодействия с нитрит-ионами в водном растворе претерпевает ряд изменений структуры, описываемых схемой: ферро-НЬ-»теіНЬ«-*теіНЬ-гіі02--»разрушение порфири-нового кольца гема и глобина.

2. Пероксинитритная кислота является промежуточным продуктом процесса взаимодействия метгемоглобин-нитрита с НзО; и инициатором наблюдаемых при этом необратимых изменений химической структуры гемоглобина в водных растворах при рН< 7,5.

3. Уровень накопления в эритроцитах нитрит-модифицированной формы гемоглобина при воздействии ка эритроциты нитрит-ионов связан с их метаболическим состоянием. При взаимодействии внутриэритроцитарного гемоглобина с нитрит-ионами образуются две ферри-формы гемоглобина -метгемоглобин и метгемоглобин-нитрнт.

4. В реакции NaNOj с HjCb в водных растворах образуются химически высокоактивные продукты - транс- и цис-изомеры пероксинитритной кислоты и ее возбужденное состояние.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных выполнены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации

Основные результаты, полученные в ходе исследований, докладывались н представлялись на Международном симпозиуме «Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов» (г. Гродно, 1995 г.), Международной научной конференции, посвященной пятилетию образования ГоГМИ (г. Гомель, 1995 г.), Международном симпозиуме «Кислород и свободные радикалы» (г. Гродно, 1996 г.), Международном научном конгрессе «Чернобыль - Вильседе» (г. Гомель, 1997 г.), 11 белорусско-российском симпозиуме «Биологические механизмы эндогенной интоксикации» (г. Гродно. 1997 г.). II и III съездах белорусского общества фотобиологов и биофизиков (г. Минск, 1996 и 1998 гг.), Международной научно-практической конференции «Экология и молодежь» (г. Гомель, 1998 г.). Международном симпозиуме «Biological Chemistry and Cellular Targets of Nitric Oxide» (г. Грая, 1998 г.), Международной конференции «Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности» (г. Минск, 1998 г.).

Опубликаватюсть результатов

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 5 научных статей (в научных журналах - 3, в сборниках научных статей - 2) и 12 тезисов докладов. Обшее количество страниц опубликованных материалов-36.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, общей характеристики, 5 глав и заключения. Список цитируемой литературы включает 269 наименований. Работа изложена на 143 страницах, содержит 6 таблиц н 39 рисунков.