Механизмы действия этанола на потенциалозависимые натриевые каналы сенсорных нейронов крысы Вилин, Юрий Юрьевич

Введение к работе

Актуальность темы. Выдающиеся отечественные ученые внесли большой вклад в изучение действия алкоголя на организм человека. И.М. Сеченов посвятил свою докторскую диссертацию физиологии алкогольного опьянения (Сеченов, 1860). Влияние алкоголя на высшую нервную деятельность позже было исследовано в работах ИГЛ Павлова (Павлов, 1949) и его учеников (Петрова, 1945; Федоров, 1949). Биохимические основы действия алкоголя на центральную нервную систему были систематически изучены в работах И. А. Сытинского (Сытинский, Ї975; .19,80).

Особое ' место в мировой литературе занимает исследование взаимодействия спиртов с ионными каналами. Несмотря на большое количество работ в этой области, специфические механизмы действия этанола (EtOH) все еще изучены в недостаточной степени. В настоящее время существуют альтернативные гипотезы, с позиций которых могут объясняться возможные молекулярные механизмы действия п-алканолов на ионные каналы.

Гипотеза "модулированного рецептора" (Armstrong and Hille 1972; Hille, 1977) объясняет наблюдаемые, эффекты связыванием лигандов с активным центром (рецептором), структурно связанным с макромолекулой ионного канала.

Согласно гипотезе Хейдона (Haydon, Urban, 1983), п-алканолы, взаимодействуя с мембраной, могут изменять ее толщину, влияя на трансмембранное электрическое поле (Haydoa et. аі., 1980) и зависимые от потенциала воротные характеристики ионных каналов (Elliott, Elliott, 1990).

Современные данные не указывают на существование конкретного молекулярного механизма действия этанола на ионные каналы. ЕЮН в концентрации 200 ммоль вызывает не зависимое от дозы снижение амплитуды натриевых ионных токов аксона кальмара (Moore et. аі., 1964). Наиболее вероятными кандидатами на роль специфической мишени действия этанола могут считаться синаптические НМДА- и ГАМКд-активируемые каналы центральных нейронов млекопитающих (Lovinger et. аі., 1989; Weight et. al. 1991; Ticku, 1991). Для этих типов каналов показано снижение амплитуды токов при действии этанола в концентрации 50 ммоль. Приложение 10 ммоль EtOH приводит к ингибированию кальциевых токов L - типа (Wang et. al., 1991). Подчеркнем, что амплитуда ионного тока является интегральным параметром."Количественныё данные

о дозозависимом механизме связывания этанола с вероятной специфической мишенью в структуре ионного канала отсутствуют.

В последнее время появились данные, что нечувствительные к тетродотоксину (ТТХ_Г) натриевые каналы, впервые обнаруженные киевскими исследователями (Веселовский и др., 1980), играют особую роль в рецепторных приборах. Натриевые ТТХ, - каналы участвуют в кодировании ноцицептивной (Borovikova, et. al., 1996) и обонятельной (Trotier, 1986) информации. Исследование процессов регуляции ТТХ_Г - каналов различными фармакологическими агентами, в частности этанолом, вероятно, позволит глубже понять физиологическую роль каналов этого типа.

Нейроны спинальных ганглиев являются хорошо изученным и удобным объектом для исследования характеристик натриевых каналов, поскольку мембрана этих клеток имеет как ТТХ_Г - каналы, так и «классические», тетродотоксинчувствительные (ТТХ,) каналы (Hodgkin, Huxley, 1952 а).

При исследовании ионных каналов весьма существенным является вопрос, происходит ли изменение их характеристик после замещения вне-и внутриклеточной среды на экспериментальные растворы. Известно, что буферы водородных ионов способны оказывать влияние на кинетические характеристики ионных каналов (Hanrahan, Tabcharani, 1990). In vivo физиологические значения рН поддерживаются бикарбонатным и фосфатным буферами. В экспериментах in vitro наиболее часто применяемыми буферами ионов водорода являются HEPES (Ы-[гидроксиэтил] пиперазин -Ы'-[2-этансульфоновая кислота]) и TRIS ([2-амино-2-(гидроксиметил) пропан-1,3-диол]). В связи с этим возникает необходимость установить, какой из двух видов буферов является более близким к бикарбонатному буферу и не влияет на характеристики активационных и инактивационных воротных систем натриевых каналов. Цели и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярных механизмов действия этанола на натриевые каналы сенсорных нейронов. Были поставлены следующие задачи:

1. Установить, какой вид буфера не влияет на инактивационное воротное устройство и эффективный заряд (Z_ea)» переносимый в активационном воротном устройстве при открывании натриевых каналов.

2. Исследовать механизмы взаимодействия этанола и воротных систем натриевых каналов, а также его влияние на Z_ccr-

3. Исследовать механизмы действия этанола на ионную избирательность натриевых каналов.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые показано, что TRIS-буфер, в отличие от HEPES-буфера, вызывает необратимые изменения воротных систем натриевых каналов, значительно ускоряя процессы инактивации и уменьшая величину переносимого Z_eg- в их активационных воротных системах. Бикарбонатный буфер не ускорял кинетику инактивационного процесса, а также не уменьшал величину Z_eff. HEPES-буфер, таким образом, является более близким к естественной бикарбонатной буферной среде, по сравнению с TRIS-буфером.

Впервые установлено, что этанол в низких концентрациях (K_D = 450 мкмоль) вызывает обратимое уменьшение Z_eff активационного воротного устройства ТТХ_Г - каналов.

Приложение этанола с двух сторон мембраны в концентрации от 10 ммоль и выше приводит к необратимому снижению ионной избирательности ТГХ_Г - и ТТХ, - каналов и смещению максимума ионной избирательности от X к XI ряду селективности Айзенмана. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные представляются важными для понимания молекулярных механизмов действия этанола на натриевые каналы сенсорных нейронов.

Результаты и выводы работы могут быть использованы в медицине и фармакологии для реализации новых способов целенаправленного воздействия на функционирование сенсорных систем при некоторых формах патологии, а также для чтения учебных курсов по биофизике, нейрофизиологии и нейробиологии.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: 1 Всероссийской конференции молодых физиологов и биохимиков России (С.-Петербург, 1995), 1 Всероссийской конференции токсикологов (С.-Петербург, 1995), Международном симпозиуме, посвященном памяти академика В.Н. Черниговского (С.-Петербург, 1997), ХХХШ Международном конгрессе физиологических наук (IUPS) (С.-Петербург, 1997), Сателлитном симпозиуме международного конгресса физиологических наук (Россия, Колтуши, 1997). По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, вывода и списка литературы, содержащего 169 источников. Работа иллюстрирована 46 рисунками.