Механизмы действия арахидоновой кислоты на регуляцию входа Са2+ в тимоциты Трепакова, Елена Сергеевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Арахідоновая кислота (АА) яелявтся одним из полифункционзльных медиаторов биохимических процессов во многих типах клеток. В покоящихся клетках АА находится в составе мембранных глицерофосфолипидов и практически отсутствует в свободной форме. Однако, при активации определенных рецепторов плазматической мембраны их соответствующими згонистами концентрация свободной АА в цитоплазма резко возрастает (Needleman. et al.,1986; Hok-in, 1985). Значительная часть - высвобожденной АА затем в течение секунд окисляется специфичесними ферментами до эйкозаноидов (McGiff, 1987; Male et al.,1987), причем профиль метаболизма АА является характерным для каждого типа клеток (Needleman et al., 1986; McGiff, 1987).

Рецептор-стимулируемый выброс АА часто сопровождается повышением внутриклеточной концентрации Са^г+ (tCa²⁺) ), как, например, в лимфоцитах, стимулированных митогенными лектинами (Perber & Reach, 1973; Parker et al.,1979; Міге-Sluia et al., 1989). Этот факт позволил предположить, что АА или ее метаболиты являются медиаторами рецептор-зависимого повышения [Са^г+] . Подтверждением этого предположения были данные, что антагонисты ферментативного окисления и высвобождения АА влияют на функции тимоцитов (Вепгепз et al.,1989) и, в частности, подавляют рецептор-зависимое повышение [Са² і (Gukov3kaya et al.,1989). Кроме того было показано, что экзогенная АА способна повышать 1Са^г+) за счет мобилизации внутриклеточных Са^г+-пулов (Volpl et al.,1980; Wolf et al.,1986; Dettbam & Pelade, 1993), а также активировать вход внешнего Са²⁺ (Alonzo et al., 1990)'и стимулировать множество Св^г+-зависимых процессов в клетках (Naccache et al.,1979; 1983; Badwey et al.,1987).

С другой стороны, было описано прямо противоположное действие АА и ряда других ненасыщенных жирных кислот. Показано, что эти вещества могут подавлять повышение базального уровня [Са²'^|"]₁ под действием различных агентов (Kolesnick & Gerahengorn, 1985; Мас-

Сокращения: PLA2 - фосфолипаза Ag; РІС - фофсолипаза С; Ю - лшго-ксигеназа; СО - циклооксигеназа; BSA - бычий сывороточный альбуиин; Con А - конканаваліш А; ІРЗ - инозитол-1,4-,5-трисфосфат; BHQ -2,5-ди-(*-йутил)~1 ,4-бензотадрохинон; PGEt и PGE2 - простагландины Е1 и Ег; РИА - фитогемэгглютинин," NDGA - нордигидрогваяретовая кислота; 5-КЕТЕ - 5-гидрокси-5,8,11,14-айкозатетраеновая кислота; EIPA - етилизопропиламилорид.

Ewan et al. ,1991), в том числе и в рецептор-активированных Т-лимфоцитах (Chow et al.,1990; Astashkln et al.,1993).

Т.о. жирные кислоты, и прежде всего АА, могут оказывать два противоположных эффекта на ГСа^г+] в разных типах клеток. Однако, несмотря на многочисленность литературных данных о действии экзогенной АА на ионный гомеостаз клеток, большинство работ носят описательный характер. Роль АА и продуктов ее окисления в трансмембранной передаче сигнала в клетках эукариот и, в том числе, в лимфоцитах остается невыясненной. Практически не исследовалось участие АА в регуляции ионного гомеостэза. покоящихся лимфоцитов, а также ее роль в формировании ионных сигналов в рецептор-зависимых процессах. До настоящего времени не предпринимались попытки исследования причины двоякого действия АА на [Са^г+1₁ в Т-лимфоцитвх, а ее эффекты рассматривались обособленно, без учета новых данных о регуляции входа Са²'¹" в клетки из внешней среды.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизмов действия экзогенной АА на' Са^г+-трансшртирущие структуры и их регуляторы, и на изменения рН. в интактных тимоцитах крысы, а также влияние АА на рецептор-зависимую Св^г+-сигнализацию в активированных клетках. Объект исследования - тимоциты крысы линии Wiatar.

Основные задачи исследования:

1. Исследование эффектов экзогенной АА на тимоциты в покое и при активации Са^г+-мобилизующими агонистами.

2. Изучение механизмов рецептор-зависимого входа Са^г+ в тимоциты и сравнительный анализ эффектов АА и митогена Con А на повышение ССа^г<"1 ;

3. Идентификация возможных внутриклеточных мишеней ингибитор-ного и [Са²⁺] -повышающего действия экзогеной АА;

4. Выяснение причины снижения рН_± под действием экзогенной АА, а также анализ вероятности участия АА в рецептор-стимулируэмом повышении ССа²'¹"] в тимоцитах крысы.

Научная новизна работы. С помощью внутриклеточных ион-чувствительных флуоресцентных зондов Quln 2 и БСЕС? нами было показано, что АА в зависимости от концентрации может оказывать два противоположных эффекта нв [Са^г+3. одного и того же типа клеток, а именно, I) ингибировать повышение [Св^г+] , индуцируемое

Са^г+-мобилизущими агентами, не влияя при этом на [Са²⁺] покоящихся клеток, - в концентрациях 0,1-1 рЛ1 и 2) активировать вход Са^г+ в клетки на фоне ІСОТ-ного подавления рецептор-зависимого Са^г+-сигнала - в концентрациях 1-100 рЫ.

На тимоцитах Епервне показано, что рецептор-эктквируемый вход Са²* в клетки определяется первоначальным повышением [Са²⁺1 за счет мобилизации внутриклеточных пулов, что, е свою очередь, акти-Еирует КМ и КМ-зависимые протеинкиназу и протеинфосфатазу. КМ-фосфатаза, вероятно, опосредует инициацию еходэ Са²⁺, тогда как КМ-киназа необходима для инактивации Са^г+-каналов при завершении -ответа.

Установлено, что тирозиновая и сАМР-зависимая протеинкиназы не принимают участия в регуляции активности Са^г+-квналов плазматической мембраны и функционируют на этапах, предшествующих мобилизации Са^г+ из внутренних пулов.

АА-индуцируемое закисление цитоплазмы определяется усилением продукции протонов внутри клетки.

АА в концентрациях 15-100 цМ индуцирует неспецифическую проницаемость плазматической мембраны, тогда как в концентрациях 0, Ills цМ АА активирует те же Сэ^г+-проЕодящие каналы, что и митоген Con А. Са""⁺-повышэющее (в отличие от Con А) и ингибиторное действие АА не связано с ее влиянием на рецепторы, TFK, PLC или КМ, а также с продуктами ее окисления, а определяется прямым влиянием на Са²⁺-каналы плазматической мембраны. Противоположность эффектов разных концентраций АА на 1Са^н+] тимоцитов, вероятнее всего, не связана с ее действием на различные типы каналов, а обусловлена разными эффектами низких и высоких концентраций АА на одни и те ке мишени, как это описано для ряда ингибиторов.

Данные указывают на то, что в тимоцитах АА не является медиатором рецептор-зависимого повышения 1Са^г+1 и не требуется для Con А-индуцируемой активации клеток.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования вносят существенный вклад в представления о механизмах генерации рецептор-зависимых ионных сигналов в тимоцитах. Полученные данные открывают новые возможности использования АА как высокоспвцифично-го ингибитора рецептор-оперируемых Са²⁺-каналов при исследовании

путей передачи рецепторного сигнала в электро-невозбудимых клетках.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на симпозиуме стран СНГ "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, май 1993); симпозиуме стран СНГ "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, сентябрь 1993); итоговой конференции ИБК (Пущино, ноябрь 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей (в том числе I - в иностранном журнале) и I тезисы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (гл.1), описания материалов и методов исследования (гл.ІІ), изложения полученных результатов и их обсуждения (гл.III), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (250 ссылок). Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включая 34 рисунка и I таблицу.