Введение к работе
Актуальность проблемы.
Взаимодействие актина и миозина лежит в основе подвижности многих биологических объектов. В мышечных клетках эти белки образуют трехмерную структуру - саркомер, состоящую из набора толстых нитей миозина, перекрывающихся с набором тонких нитей актина. Скольжение актиновых нитей вдоль миозиновых нитей происходит в результате циклического взаимодействия концевых частей молекул миозина, называемых поперечными мостиками, с актином. Этот процесс обеспечивается энергией гидролиза АТФ.
В настоящее время хорошо изучены основные характеристики сокращения мышц и волокон - в частности, зависимости длина-сила, сила-скорость и скорость-жесткость. Полученные данные позволили сформировать современную теорию мышечного сокращения, сформулированную в работах Хаксли, Симмонса и других авторов.
Однако для подтверждения теории потребовалось исследовать механические свойства отдельных молекул миозина, взаимодействующих с филаментом актина. Разработанные в последние годы уникальные методы искусственных подвижных систем (ИПС) и оптической ловушки позволили измерить длину силогенерирующего шага отдельных поперечных мостиков и развиваемое мостиками напряжение. Было исследовано движение филаментов актина по поверхности, покрытой молекулами миозина или его субфрагментами. Но попытки измерить дистанцию, на которую молекулы миозина сдвигают актин за один цикл гидролиза АТФ, дали противоречивые результаты.
Были предприняты попытки измерить эту дистанцию, используя импульсный фотолиз инактивированной АТФ в демембранизированных мышечных волокнах. В этом случае миозин способен начать цикл гидролиза АТФ только после фотолиза ее ультрафиолетовым светом. К сожалению, большое количество высвобождающейся АТФ и высокая концентрация мышечных белков в волокне затрудняют интерпретацию событий, связанных с одним циклом гидролиза АТФ.
Поэтому на сегодняшний день остается ряд вопросов, связанных < механохимическим циклом молекулы актомиозина. В частности, измерение характеристик отдельных молекул и согласование этих данных в рамка? модели взаимодействия миозина и актина.
Лель работы состояла в изучении молекулярного механизме механического взаимодействия актина и миозина и построении модели индивидуальных поперечных мостиков, взаимодействующих с филаментом актина.
Научная новизна:
Новым методом была измерена дистанция, на которую молекулы миозина сдвигают филамент актина за один цикл гидролиза АТФ в изотонических условиях.
Установлено, что за один цикл гидролиза АТФ миозин можеі совершить только один силогенерирующий шаг при нулевой нагрузке.
Впервые было измерено время от момента связывания АТФ одиночной молекулой актомиозина до момента механического разрыва связи актин-миозин в условиях внешней нагрузки.
Разработана математическая модель, основанная на описании взаимодействия индивидуальных поперечных мостиков (ПМ) с филаментом актина, позволяющая предсказать поведение актомиозиновых комплексов, которое в настоящее время невозможно проверить экспериментально.
Предположено и доказано в модели, что гиперболическая форма зависимости сила-скорость возникает при взаимодействии небольшого (15-20) числа молекул миозина с филаментом актина.
Научная и практическая ценность.
Настоящая работа носит экспериментальный и теоретический характер. Она посвящена одной из важных проблем биофизики - изучению молекулярного механизма взаимодействия актина и миозина. В результате
„з~
исследования получены принципиально новые данные, дополняющие современные представления о механизме мышечного сокращения.
Показано, что один цикл гидролиза АТФ связан с одним шагом поперечного мостика в изотонических условиях, что подвергалось сомнению в последние годы (Harada Y. et al., 1990; Irving M. et al., 1992; Ishijima A. et al., 1994).
С высокой точностью измерен размер шага поперечного мостика в условиях нулевой нагрузки.
Доказано, что между моментом связывания молекулы АТФ и механическим разъединением молекул актина и миозина существует определенная задержка (8-12 мс).
Разработан новый метод исследования механохимического цикла АТФ миозина в условиях ИПС, который может быть применен для широкого круга исследований свойств миозинов из различных типов мышц. Небольшие количества мышечной ткани, необходимые для приготовления белков, позволяют использовать этот метод для изучения мышечных белков, полученных при биопсии для изучении патологии скелетных мышц и сердца человека.
Разработан новый простой метод очистки тяжелого меромиозина непосредственно в рабочей камере, улучшающий качество экспериментов.
Разработанная модель адекватно воспроизводит результаты экспериментов in vitro и может быть применена без каких либо изменений для моделирования поведения мышечных волокон в различных механических условиях. Модель может быть использована для обучения студентов основам теории мышечного сокращения.
Апробаиия работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на XXIV Европейском Мышечном Конгрессе (Флоренция, 1995); XXV Европейском Мышечном Конгрессе (Монпелье, 1996); ученом совете института физиологии УрО РАН (Сыктывкар, 1996).
По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
„4-
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов экспериментов, описания модели и результатов ее тестирования, а также выводов. Диссертация изложена на 150 страницах, включая 24 рисунка и список литературы из 145 наименований.