Введение к работе
Актуальность исследования: Участие нейронального актина в синаптической пластичности привлекает в последнее время пристальное внимание [Fifkova, 1995; Niethammer et al., 1998]. Локализуясь в пре- и постсинаптических областях, этот белок обеспечивает транспортировку везикул к активным зонам и секрецию медиаторов [Tamie et al., 1994], выполняет адгезионную роль, удерживая синапсы в топографически определенном месте и создавая, таким образом, строго специфические межнейронные связи [Liberman, Spacek, 1997], регулирует функцию постсинаптических рецепторов [Rosenmund, Westbrook, 1993]. Модификация актина в любом из этих звеньев неизбежно приводит к модуляции синаптической функции. Установлено вовлечение актина в долговременную потенциацию синаптической передачи как химического [Pavlik, Moshkov, 1992], так и электротонического [Moshkov et al., 1998] сигналов, в создании и поддержании резистентности к утомительным стимуляциям [Павлик и др., 1997; Tiras et al., 1999]. При изучении механизмов синаптической пластичности для выяснения роли в них нейронального актина широко применяют физиологически активные вещества, специфически взаимодействующие с актином, изменяя его агрегатное состояние и другие свойства [Павлик и др., 1997; Павлик и др., 1998]. Пользуясь ими как тонкими фармакологическими инструментами, оказывается возможным не только определить функциональный вклад актина в поведение нейрона, но также выяснить локализацию актина, и, следовательно, увидеть то звено в структуре синаптического аппарата, в функционировании которого он, возможно, принимает участие. До сих пор обнаружение таких специфических соединений, выделяемых из животных и растительных объектов, можно рассматривать как явление случайное[Раіг et al., 1995; Bai et al., 1995; Shin-ya Saito et al., 1997]. Набор таких веществ ограничен. Кроме того, некоторые из них токсичны, другие плохо или совсем не проникают в клетку. Поэтому расширение списка препаратов, которые способны специфически взаимодействовать с цитоскелетным актином, является в настоящее время актуальной задачей. Перспективным источником токсинов, обладающих различными свойствами, являются яды паукообразных и других ядовитых членистоногих [Neurotoxins, 1996]. Однако, существование в них физиологически активных соединений прямого цитоскелетного ДСЙСТВІИ до сих пор не установлено. Негативным фактором, по-видимому, служит неадекватность объектов, которые используются для скрининга этих ядов. Такими объектами в силу ряда причин могли бы стать Маутнеровские нейроны (МН) костистых рыб. Предыдущими исследованиями установлено, что их функция в существенной мере зависит от актина. Это уникальное свойство воспроизводимо идентифицируется в морфофункциональных экспериментах [Мошков, 1985; Tiras et al, 1992; Moshkov et al., 1998]. Актина в МН много, и часть
его локализована в компактных образованиях синалтических контактов, так называемых десмосомоподобных контактах (ДПК) [Янюшина и др., 1990; Павлик и др., 1997], от состояния которых зависит функциональное состояние нейронов и структуру которых легко контролировать электронномикроскопически [Moshkov et al., 1980]. Крупные размеры этих уникальных нейронов, их строгая топография в мозгу облегчает аппликацию различных физиологически активных веществ, в том числе ядов насекомых [Тирас; Мошков, 1980; Мошков и др., 1981]. Однако, требуются комплексные морфофункциональные исследования, чтобы показать пригодность МН для испытания ядов паукообразных с целью поиска нейротоксинов, взаимодействующих с цитоскелетом.
Цель и основные задачи исследования. Целью данной работы была разработка нового подхода для скрининга цельных ядов и фракций ядов паукообразных с целью идентификации среди них таких физиологически активных соединений, которые активно взаимодействуют с цитоскелетом и его актиновым компонентом, используя для этого в качестве тест-объекта Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки. Были поставлены следующие задачи.
-
Исследовать возможность использования Маутнеровских нейронов золотой рыбки в качестве тест-объекта для дифференцированной оценки нейротоксичности цельных ядов некоторых видов паукообразных и губоногих.
-
Изучить функциональное состояние и ультраструктуру МН в близкие и отдаленные сроки после аппликации цельного яда среднеазиатского черного скорпиона и длительной естественной стимуляции.
3. Разделить цельный яд скорпиона на фракции, проанализировать
их влияние на функцию МН и сравнить эффект некоторых из них с
воздействиями, которые специфически изменяют состояние
нейронального актина.
-
Разработать методику прямой диагностики in vitro функционального состояния МН в условиях нормы, утомления и резистентности к утомлению, индуцированной in situ естественными тренировками или аппликацией фракции яда.
-
Провести сравнительный качественный и количественный ультратруктурный анализ контактов афферентных химических синапсов МН после различных экспериментальных воздействий, известно изменяющих состояние нейронального актина, и аппликаций фракций яда скорпиона неизвестного механизма действия, а также исследовать взаимодействие этих фракций с хроматографически чистым актином.
Научная новизна работы. Впервые было показано, что рыбы и их МН являются адекватными объектами для проведения скрининга ядов неизвестного происхождения и неустановленного действия с целью поиска новых нейротоксинов и физиологически активных соединений.
Установлено, что использование этих объектов имеет ряд преимуществ, главным из которых является возможность одновременного проведения комплекса токсикологических исследований разного уровня организменного, тканевого, клеточного и субклеточного, затрачивая при этом весьма малую дозу исследуемого препарата. Впервые показано, что апплицнруя цельные яды на МН, можно дифференцировано определять нейротропную активность, степень нейротоксичности, а при необходимости и цитотоксіг-іность яда, что является необходимым шагом на пути дальнейшего анализа активных компонентов ядов после соответствующего их фракционирования. Впервые было проведено испытание цельного яда среднеазиатского черного скорпиона, ранее в токсикологических экспериментах на этом объекте не изучавшегося. Обнаружено, что при аппликациях яда скорпиона на МН рыб раздельно и в сочетании с длительной естественной стимуляцией (ДЕС) яд, обладая сильной токсичностью, проявил неизвестный ранее защитный эффект от угнетающего действия ДЕС, который выразился в быстром восстановлении исходной функции и ультраструктуры МН. Определено, что некоторые фракции, выделенные из цельного яда скорпиона, хорошо воспроизводят отдельные свойства, отмеченные у цельного яда. Одна среди них обладала сильно выраженным протекторным свойством, а другая, наоборот, как и ДЕС угнетала функцию МН. Выявлена аналогия между морфофункциональным эффектом фракций яда скорпиона и испытанными в тех же условиях специфическими воздействиями на МН, изменяющими состояние нейроналыюго актина известным образом. Установлено, что мишенью действия фракций являются актин-содержащие специализировашше структуры синаптических контактов. Впервые показан прямой эффект указанных фракций яда скорпиона на хроматографически чистый актин. Фракция, повышающая резистентность МН к утомлению, трансформировала G-актіш в F-актин и индуцировала формирование пучков. Фракция, угнетающая функцию МН, разрушала F-актин. Таким образом, получены абсолютно новые данные о существовании в яде скорпиона фракций, взаимодействующих с нейрональным актином, которые впоследствии могут послужить объектом для дальнейшей очистки и молекулярно-биологической идентификации. Впервые разработана методика электрофизиологической диагностики функционального состояния МН in vitro после косвенной оценки его по поведению, измененному аппликацией физиологически активных веществ или естественной стимуляцией. Выявлена схожесть результатов оценки функционального состояішя МН прямым и косвенным методами.
Научно-практическая ценность работы.
Проведенное исследование имеет большую теоретическую ценность, так как впервые показывает существование в цельном яде скорпиона компонентов, взаимодействующих с цитоскелетом, что расширяет наши представления об окружающем мире. Данные
результаты имеют определенную практическую значимость при разработке подходов к исследованию веществ, выделяемых из других животных и растительных объектов и обладающих потенциальной специфической токсичностью неизвестного спектра действия. Использование МН как тест-объекта может способствовать расширению этих исследований с целью идентификации новых нейротропных соединений и нейротоксинов или новых свойств у известных нейротоксинов. Выделенные и охарактеризованные фракции яда скорпиона уже на достигнутом уровне очистки могут оказаться полезными нейрофармакологическими инструментами, пригодными для исследования актина in vitro и для тонких вмешательств in vivo в структурную организацию и функцию цитоскелета живых клеток, для выяснения механизмов пластичности, адаптации и памяти на клеточном и мембранном уровнях.
Результаты работы используются при чтении курса лекций в ПущГУ.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на 1-ой, И-ой и IV-ой научных конференциях молодых ученых города Пущино (Пущино, 1996, 1998, 1999), на Ш-ей международной конференции по функциональной нейроморфологии (С-Петербург, 1997), на П-м Всероссийском биофизическом съезде (Москва, 1999), на аттестационном Ученом совете ИТЭБ РАН и на совместном заседании лаборатории системной организации нейронов и Пущинского отделения Физиологического общества России в 1999 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа
состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования,
результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка
литературы. Содержание работы изложено на страницах