Люминесцентный анализ механизмов вкусовой рецепции Новикова, Наталия Георгиевна

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время, несмотря на большое количество экспериментальных исследований, выполненных с помощью современных методик (см. обзоры: Avenet, Lindcmann, 1989; Gilbertson, 1993; McLaughlin, Margolskee, 1994; Margolskee, 1993a,b; Schiffman, Gatlin, 1993; Schmale et al„ 1993 и др. ), не существует единой точки зрения на механизмы преобразования информации во вкусовых рецепторах. Относительно малоизученным остается вопрос о роли метаболических систем рецепторной клетки во вкусовой транедукции. Наряду с традиционным мнением, что роль метаболических систем сводится к энергетическому обеспечению деятельности рецепторных клеток, существуют данные о непосредственном участии этих систем в акте рецепции (Соловьев, 1978; Самойлов, 1980,1983).

Перспективным методом, позволяющим исследовать метаболические реакции рецепторных клеток in situ, является микроспектрофлуориметрический метод. В работах В.О.Самойлова и его сотрудников (Самойлов, 1980,1983; Самойлов и соавт., 1980, 1981; Соловьев,1978; Дулатова, 1988) было впервые показано, что при действии на вкусовые сосочки языка лягушки адекватных химических стимулов возникают изменения флуоресценции компонентов дыхательной цепи - пири-диннуклеотидов и флавопротеидов, а также хлортетрациклина - флуоресцентного зонда на мембраносвязанный Са⁺. На основании этого феномена В.О.Самойловым сформулирована гипотеза гетерогенности механизмов вкусовой рецепции. Согласно этой гипотезе, вещества, воспринимаемые человеком на вкус как горечи и кислоты, вызывают преходящие нарушения метаболизма вкусовой клетки, что служит одним из начальных звеньев хемосенсорного акта. Однако включение метаболических реакций раздражителями этих типов, по мнению автора, осуществляется по-разному: кислоты, вероятно, изменяют внутриклеточный рН (возможно, с участием фермента карбоангидразы) и непосредственно влияют на метаболизм; горечи же могут изменять метаболизм клетки посредством активации системы цАМФ, причем существенную роль в этих процессах играют ионы Са²⁺.

Вместе с тем в вышеуказанных исследованиях не было проведено сопоставления динамики развития люминесцентных реакций вкусовых сосочков с временными характеристиками электрофизиологических реакций во вкусовых нервах, а также не была установлена последовательность метаболических реакций во вкусовых клетках. Нам неизвестны также работы авторов из других научных школ, содержащие попытки количественной многофакторной оценки метаболических реакций вкусовых рецепторов и построения математических моделей этих реакций. Следует заметить, что при большом количестве информации о механизмах рецепции различных вкусовых стимулов наименее определенными являются представления о механизмах действия кислот. В частности, до сих пор не были показаны изменения in situ внутриклеточного рН при действии на вкусовые со-

сочки кислот, хотя принципиальная возможность этого широко обсуждается в литературе.

Изучение механизмов хеморецепции было предусмотрено Государственными программами "Мозг", "Гомеостаз", "Феромон", в рамках которых и началось выполнение данной работы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в изучении посредством люминесцентного анализа закономерностей метаболических реакций рецепторного эпителия языка лягушки на комбинированное действие химических стимулов и уточнении роли этих реакций в акте вкусовой, трансдукции.

1. Провести сравнительный анализ динамики изменений собственной флуоресценции компонентов дыхательной цепи митохондрий - пиридиннуклеотидов и флавопротеидов, а также свечения флуоресцентных зондов (хлортетрациклина и флуоресцеиндиацетата) при действии на вкусовые сосочки языка лягушки химических стимулов, представляющих три "вкусовые качества" - кислое, горькое и соленое.

2. При помощи флуоресцеиндиацетата - флуоресцентного зонда на внутриклеточный рН - уточнить представления о механизмах рецепции кислот вкусовыми клетками.

3. С использованием методов математической теории эксперимента провести математический анализ динамики люминесцентных реакций при комбинированном действии трех вкусовых стимулов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Благодаря сравнительному анализу динамики собственной флуоресценции компонентов дыхательной цепи митохондрий и люминесценции флуоресцентных зондов во вкусовых почках языка лягушки под действием химических стимулов, представляющих три "вкусовых качества" - кислое, горькое и соленое, установлены выраженные различия в характере и временных характеристиках метаболических реакций рецепторного эпителия языка при действии раздражителей различных вкусовых модальностей, что подтверждает гипотезу гетерогенности вкусовой рецепции (Самойлов, 1980, 1983).

Впервые обнаружены изменения люминесценции флуоресцеиндиацетата (ФДА), свидетельствующие о снижении внутриклеточного рН в рецепторном эпителии языка при действии на него кислот. Установлено отчетливое влияние анионного компонента кислот на степень снижения рН вкусовых клеток, а также резкое усиление люминесцентных реакций ФДА при действии растворов кислот на бикарбонатном буфере. Угнетение этих реакций ацетазоламидом свидетельствует об участии карбоангидразы в рецепции кислот вкусовыми клетками.

С помощью методов математической теории эксперимента (МТЭ) впервые построены математические модели, описывающие развитие метаболических реакций вкусовых почек во времени, что позволило количественно оценить роль каждого из вкусовых раздражителей в сенсорном акте по отдельности и во взаимодействии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные факты и модели расширяют современные знания о первичных механизмах рецепции веществ, пред-

ставляющих различные вкусовые модальности, и включены в курсы лекций и практических занятий по биофизике органов чувств для студентов Санкт-Петербургских медицинского и электротехнического университетов. Результаты работы могут быть использованы при создании новых датчиков и сенсорных устройств в робототехнике. Существенные усовершенствования, внесенные автором в традиционную методику регистрации и анализа люминесцентных сигналов, в полной мере пригодны для изучения люминесценции других биообъектов. Метод активного многофакторного эксперимента, проводимого по оптимальным планам МТЭ, примененный для построения и оценки качества моделей исследуемых процессов и позволивший получить новые достоверные научные факты, рекомендован для изучения других сенсорных систем.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1.Выраженные различия в характере и временных характеристиках метаболических реакций вкусового эпителия языка лягушки на химические стимулы, представляющие различные вкусовые "качества", подтверждают гипотезу гетерогенности вкусовой рецепции (Самойлов, 1980, 1983).

2. Под действием кислот снижается рН в цитоплазме вкусовой клетки. Усиление реакций на кислоту при наличиии бикарбоната в ротовой полости связано с образованием там С0₂, его быстрой диффузией через плазмолемму вкусовой клетки с последующим превращением в угольную кислоту при помощи цитоплаз-матической карбоангидразы.

3. Математические модели метаболических реакций вкусового эпителия на химические стимулы разных вкусовых модальностей, полученные в многофакторном исследовании с использованием микроспектрального анализа и методов математической теории эксперимента, позволяют количественно оценить роль исследуемых факторов и их взаимодействий, что способствует углублению представлений о механизмах трансдукции во вкусовых клетках.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VII Симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Москва, Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, февраль 1992 г.), на семинарах кафедр биологической и медицинской физики, челюстно-лицевой хирургии Военно-медицинской академии, лаборатории биофизики Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. И.П. Павлова, отдела автоматизированных информационных систем Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова, а также кафедры биофизики Санкт-Петербургского технического университета.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунками и 17 таблицами. Список литературы включает 73 работы отечественных и 255 работ иностранных авторов.