Введение к работе
Актуальность проблема. Основной задачей работ, направленных на поддержание генетического разнообразия биосферы на современном этапе является разработка криобиологических методов длительного хранения инициирующих тканей. Для таких целей у растений в первую очередь должны быть использованы семена и вегетативно размножающиеся побеги, которые исходя из особенностей физиолого-биохимичес-кого и генетического строения являются наиболее приемлемыми объектами для осуществления длительного хранения генетических ресурсов растений (Вепринцев, 1984).
Развитие теоретических исследований в этой области связано с выяснением механизмов устойчивости к температурам, при которых проводится криоконсервация, а также с разработкой представлений о возникновении криоповреадений и реабилитацией биологических объектов. По имеющимся в криобиологической литературе представлениям, особенности действия низких температур на биологические объекты описываются несколькими гипотезами, в которых снижение устойчивости к замораживанию-отогреву связывают с эффектами денатурации макромолекул, гиперконцентрацией клеточного содержимого, температурными и осмотическими шоками, а также изменениями липидных и белкошх взаимодействий компонентов мембран (Levitt, 1979; Lovelock, 1957; Meryman, 1956; Mazur, 1966; Осташко, 1976; Белоус, 1982 и др.). Эти представления в настоящее время успешно развиваются в фундаментальных работах В.И.Грищенко (1987), В.А.Моисеева (1987), В.Й.Лугового (1986), В.А.Бондаренко, Л.Ф.Розанова (1987), Е.А.Гордиенко (1986) и др.
Однако, основная масса работ в области криобиологии описывает процессы, происходящие в тканях животных, специфика которых не позволяет объяснять особенности криоповреадений клеток растений, обладающих значительно большими, чем животные клетки интервалами устойчивости к изменениям оводненности, а также способностью без искусственных воздействий переходить в состояние криобиоза.
Как следует из данных опубликованных в литературе, криоповреж-дения, возникающие при криоконсервации, в большинстве случаев сводятся к процессам льдообразования и мало учитывается криолабиль-ность других клеточных систем. Несмотря на то, что адаптивной мишенью для животных и растительных клеток в формировании процессов устойчивости к низким температурам является мембрана (Крепе, 1981), специфика механизмов устойчивости растительных мембран все еще
.-2-
требует детального и всестороннего исследования. Это вызвано тем,
что у растений невыясненными остаются процессы устойчивости мембран к низкотемпературным стрессам, а также особенности структурно-функциональных изменений этих образований при переходе организмов в состояние криобиоза. Основной сложностью при решении этих вопросов является то, что механизмы устойчивости растений в естественных условиях обитания (при температурах не ниже -50С) не могут быть адекватно перенесены для условий, необходимых для осуществления длительного хранения генетических ресурсов (температуры не выше -120С). Другой особенностью является то, что растения обладают значительно большими интервалами изменений функциональных состояний и соответственно более глубокими изменениями структурно-функциональной организации мембран, роль которых при формировании состояния криобиоза практически не исследована.
Цель и задача работы. В связи с изложенным выше, целью настоящей работы являлось изучение механизмов структурно-функциональных изменений субклеточных структур, включающих плазмалемму, элементы кортикального слоя цитоплазмы, тилакоиды хлоропластов и клеток целых организмов, которые происходят при формировании состояния крио-резистентности (т.е. состояния, предшествующего возникновению устойчивости к низким температурам), а также разработка способов повышения криоустойчивости объектов, используемых для длительного хранения генетических ресурсов растений.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Исследовать механизмы возникновения криоповревдений у различающихся по устойчивости к дегидратации растительных объектов при изменении функциональных состояний и выбрать модели для исследования модификаций мембранных структур при действии низких температур.
-
Установить основные этапы формирования состояния криоре-зистентности у устойчивых к действию низких температур растительных объектов и исследовать роль плазматических мембран в этих процессах.
-
Выявить генерализованные эффекты, возникающие при действии низких температур на криолабильные объекты и установить их принципиальные отличия от криорезистентных форы.
-
Исходя из специфики компенсаторных процессов у различающихся по устойчивости к низким температурам растительных объектов,
- З -исследовать изменения структурообразующих элементов клетки в условиях криостресса и установить характер взаимосвязей мембран с цитоплазмой при возникновении или отсутствии криоповреждений.
5. На основании полученных экспериментальных данных разработать ноше способы криоконсервации растительных объектов, которые позволяют в стабильных условиях осуществлять длительное хранение генетических ресурсов растений.
Научная новизна работы. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция о формировании состояния криорезистентности для растительных организмов. Показано, что развитие состояния криобио-за определяется усилением процессов агрегации компонентов экзо-и эндоплазмы, выполняющих стабилизирующую функцию структурной организации клетки и препятствующих возникновению низкотемпературных стрессов. Предложена экспериментальная модель, позволяющая исследовать модификации плазматических мембран криорезистентных и криолабильных растительных клеток, основанная на эффектах криостресса (исключающая перемещение воды в гидратированных доменах), с помощью которой установлены отличия в топографии структурных и функциональных перестроек у различающихся по устойчивости к низким температурам растительных объектов.
Установлено, что начальными этапами криоповреждений низко-гидратированных тканей при криострессе являются нарушения взаимосвязей плазмалеммы и'клеточной стенки, в результате чего прекращается апопластный- транспорт корневой меристемы.
Впервые показано, что возникающая при небольших отрицательных температурах на поверхности плазмалеммы конденсация осмиофиль-ных компонентов способствует формированию состояния криорезистентности клеток паренхимы. На основании этих эффектов предложен способ пролонгированной субнулевой дегидратации растительных тканей, который позволяет ускорить переход гидратированных объектов в состояние криобиоза.
Показано, что наиболее устойчивыми к низкотемпературным стрессам у высокогидратированных объектов являются ткани, вымораживание воды у которых происходит в небольшом температурном интервале, сдвинутом в сторону низких температур. Обнаружены и изучены явления гистерезиса интенсивности сигнала ЯМР в цикле замо-ракивании-отогрева препаратов растительных мембран, существование которлх свидетельствует о большей лабильности этих структур.
Вперше наделен криолабильный., Са +-эаЕИСимдй само собирающий-
- 4 -ся компонент супернатанта (СКС), чувствительность которого к крио-стрессу выражается в перестройке процессов агрегации входящих в него компонентов.
Получены экспериментальные доказательства тому, что возникновение криоповреждений поверхностных структур плазматической мембраны клеток коры древесных в состоянии вынужденного покоя в первую очередь происходят в областях повышенной подвижности бислоя, которые ассоциированы с фибриллярными элементами цитоскелета.
Разработаны биотехнологии криоконсервации растительных объектов для длительного хранения генетических ресурсов растений, которые защищены авторскими свидетельствами на изобретения СССР.
Исследования низкотемпературных модификаций мембран растительных объектов, отличающихся по уровню содержания воды в тканях, а также по устойчивости к низким температурам, и происходящих при этом процессов агрегации и дисперсии компонентов примембранных слоев цитоплазмы при криострессах положенные в основу концепции формирования состояния криорезистентности растений представляют собой новое направление в криобиологии - криофитофизиологию мембран.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований получены экспериментальные результаты, позволившие сформулировать концепцию о формировании состояния криорезистентности, а также выдвинуть гипотезу о криолабильном домене растительной мембраны, которая позволяет объяснять ранее не известный в криофитофизиологии принцип стабилизации клетки в результате низкотемпературной конденсации на поверхностях мембран цитоплазматических компонентов. Эти представления дополняют теорию криоповреждения и криозащиты биологических систем, обладающих различной устойчивостью к дегидратации. При этом обоснованы основные принципы формирования состояния криобиоза у растений переходящих из одного функционального состояния в другое. Выявленный при полимеризации компонентов супернатанта цитоплазматических мембран комплекс, обладающий одновременно чувствительностью к криострессу и к двувалентным катионам, дал возможность подтвердить общебиологический принцип об общности процессов устойчивости к низким тем- лературам и объемным изменениям цитоплазмы в результате стрессовых воздействий.
Практическая значимость работы заключается в применении полученных представлений для повышения устойчивости растений к действию низких температур и различного рода стрессовых воздействий. Полученные данные о формировании состояния криорезистентности использованы для разработки биотехнологий криоконсервации растительных объектов с различным уровнем гидратации тканей и положены в основу метода пролонгированной субнулевой дегидратации тканей, защищенного авторскими свидетельствами на изобретения (А.с. СССР № 1243545, 1986, А.с. СССР !,' 1386653, 1987), которые используются в исследованиях, проводимых во Всесоюзном НИИ растениеводства юл. Н.И.Вавилова, Агрофизическом институте, Институте физиологии растений и генетики АН УССР, учреждениях Госагропрома УССР и Институте физиологии и биохимии растений АН МССР.
Основные положения выносимые на защиту;
-
В отличие от традиционных представлений о механизмах повышения устойчивости растений в естественных условиях обитания, процессы устойчивости к низким температурам, при которых осуществляется криоконсервация генетических ресурсов, обусловлены особым комплексом специализированных реакций, связанных с происходящей при небольших отрицательных температурах конденсацией диффузно расположенных в клетках компонентов. Для проховдения этих реакций необходимо изменить структурно-функциональную организацию клетки таким образом, чтобы миграция и подвижность лабильных доменов мембран и структурных элементов цитоплазмы не претерпевала существенных изменений при криострессах. Одновременно необходимо снизить реактивность организма и создать условия охлаждения, при которых скорости снижения температуры и кинетика изменения влажности объекта соответствовали бы скоростям эндогенных процессов, приводящих к формированию криорезистентности.
-
Устойчивость плазмалеммы клеток паренхимы к криоповрежде-ниям и низкотемпературным стрессам, а также стабильность микроокружения мембран формируется при наличии жидкой фазы в клетке. Учитывая большую гетерогенность всей системы и различную морфологию гидратированных макромолекул в плоскости бислоя, можно предполагать, что эффекты кристаллизации воды, вызывающие дегидратацию мембран, в первую очередь повреждают поверхностные компоненты мембран.
3. Наиболее устойчивой к действию низких температур является растительная клетка, которая в цикле замораживания-отогрева аналогично меристематической имеет сравнительно небольшие изменения объема, а следовательно термодинамически более устойчивые структурные элементы цитоплазмы.
Апробация работы. Основные материалы диссертации в форме докладов и сообщений были представлены и обсуждены на Международном конгрессе по холоду (Венеция, 1979); П и Ш Мевдународной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест, 1980, 1984); заседаниях секций Научного совета по криобиологии и криоме-дицине АН УССР (Киев, І98І-І983, Харьков, 1985), УП и УШ Всесоюзных симпозиумах по водному режиму растений (Киев, 1981, Ташкент, 1984); Республиканских конференциях "Электронная микроскопия и вопросы диагностики" (Кишинев, 1981, 1986); Всесоюзном совещании по вопросам адаптации древесных к экстремальным условиям среды (Петрозаводск, 1981, 1989); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Европейском криобиологическом обществе (Харьков, 1983) У и УІ Всесоюзных симпозиумах по ультраструктуре растений (Кишинев, 1983, Чернигов, 1989); Европейском конгрессе по электронной микроскопии (будапешт, 1984); II Всесоюзной конференции "Теоретические и прикладные вопросы криобиологии" (Харьков, 1984); Международном совешании ШЕСКО "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины" (Харьков, 1988); ХХУ Юбилейном совещании и симпозиуме "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата" (Болгария, 1988);.Всего по материалам диссертации опубликовано 39 научных работ, получено 2 авторских свидетельства на изобретение СССР.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двенадцати глав, заключения и выводов. Работа изложена на 226 страницах машинописи, иллюстрирована 42 рисунками, 2 схемами, 31 таблицей и содержит 26 страниц приложения. Библиография включает 410 источников.