Введение к работе
Актуялміость темы диссгртаціш. Универсальной формой энергии для всей биосферы является махроэргнческал связь молекулы АТ<2>, которая синтезируется полнфер-меитными системами энерлопродукшш трех основных типов: 1) субстратное фосфорн-лирование или гликолиз; 2) окислительное фосфорилирование; 3) фотосинтетнческое фосфорнлированне. Два передних механизма играют доминирующую роль в энергетическом метаболизме большинства клеток, тогда как гликолиз, в связи с его низкой эффективностью, имеет ограниченное, дополняющее значение.
Окислительное и фотофосфорилнрованне, несмотря на различие в источниках потребляемой энергии (свет и окисляемые химические субстраты), организованы принципиально сходным образом и обычно обозначаются обидим термином "мембранное фосфорилирование". В обоих случаях фосфорилирование связано с переносом электронов и осуществляется в особой структуре - сопрягающей мембране. И в том, и в другом случае энергия потока электронов в редокоцепн первоначально трансформируется в трансмембранний электрохимический градиент протонов (ДдН ), который в дальнейшем служит движущей силой синтеза ЛТ<2>.
Минул уже 35 лет с тех пор, как лауреат НсКЗелевской премии П. Митчелл [P.Mitchet!, 1961] постулировал функцию ДиН в честве центрального энергетического интермедиата в реакциях окислительного и фотосинтетического фосфорилирования, однако молекулярные механизмы его генерирования и утилизации мембранными мультисубъединичными комплексами, основополагающие принципы их функционирования во многом остаются неясными.
Становится все более очевидным, что мембранное фосфорилирование представляет собой биофизический процесс и не может быть сведено к последовательности биохимических реакций. Как свидетельствуют новейшие биоэнергетические исследования 2-3-х последних лет, представления об участии белковых конформационных перестроек в актах формирования и потребления протонного потенциала на сопрягающей мембране могут быть наиболее плодотворной и универсальной концепцией молекулярных механизмов преобразования энергии. Конформационная гипотеза сопряжения была предложена еще в конце 60-х гг. [Воуег, 1%5, Конев, 1969], однако и до настоящего времени не получила широкого признанім.
В связи с этим, экспериментальное обоснование роли конформационных переходов энергосопрягающих мембранных комплексов как ключевой, универсальной стадии
2 процессов трансформации энергии при окислительном фосфорилировании представляет
собой актуальную проблему биоэнергетики и биофизики.
Более 90% кислорода, потребляемого в биосфере, приходится на долю терминальных оксидаз аэробных организмов, глазным образом - цитохром-с-оксидазы [Babcock, WikstrOm, 1992]. С каталитической ахтивнсклио оксидаз сопряжена их энергозапасающая функция - в дыхательных цепях самого различного происхождения они служат зоной акцептирования энергии потока электронов и запасания ей в стабильной форме - вначале в форме АцН , а затем - АТФ.
В последние годы исследованию терминальных оксидаз посвящено наибольшее число работ в области биоэнергетики. К настоящему времени у ряда оксидаз достаточно полно охарактеризована структура активного центра, пути внутримолекулярного переноса электронов, интермедиаты кислородного цикла. Однако главная проблема - проблема механизма трансмег'оанного электрогенного транспорта протонов оксидазными комплексами веб ещ4 остается нерешённой. Таким образом, выяснение закономерностей и механизмов сопряжения каталитической и энергопреобразующей функций терминальных оксидаз представляет собой важнейшую, актуальную задачу биоэнергетики и биофизики.
Связь работы с крупными научными программами. Различные этапы данного исследования входили в плановые темы Лаборатории биофизики и фотобиологии мембран Института фотобиологии АНБ: "Мегастабклькые напряженные состояния биологических мембран как фактор функциональное активности клеток" и "Осмоиндуцированные напряжённые состояния биологических мембран в биоэнергетических процессах и реакции нормализации клеточного объема* (№ госрегистрацш. :996176), которые включены в государственную программу фундаментальных исследований "Регуляция 03". Часть работы выполнялась в рамках республиканской программы фундаментальных исследований (№ госрегистрации 01.89036810) и МП-07 Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь.
Цель н задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось выяснение роли конфориацнонньи перестроек знергосопрягающнх полипептидных комплексов митохондриальной мембраны в процессах преобразования энергии.
В исследовании предполагалось установить:
- влияние ограничения способности к конформационным перестройкам сопрягающих комплексов митохондриальной мембраны путем внугрибелкового ковалентного сшивания на их функциональные параметры -скорость транспорта электронов и эффективность утилизации энергии; -
э действие протеолиза митохондрий на барьерные свойства внутренней мембраны,
электронтранспортную и протонпереносящую характеристики их дыхательной цепи;
возможность накопления АТФ митохондриями в отсутствие окисляемых субстратов за счет энергии белковых конформационных перестроек, вызываемых циклом температурных сдвигов "О - +25С";
действие гипоосмотнческого растяжения и гиперосмотического сжатия митохон-дриальной мембраны на п.^аметры взаимодействия ей интегрального комплекса - ци-тохромоксидазы - с лигандом-ингибнтором и термоустойчивость белковых ансамблей дыхательной цепи;
влияние видимого света на функциональную активность дыхательной цепи митохондрий и изолированной цитохромоксидазы, заингнбированных цианидом;
фотоиндуцироеанные изменения спектральных параметров окисленной формы изолированной цитохромоксидазы, а также ей цианидного комплекса;
регуляторное действие физиологических концентраций АТФ на каталитические, лигаг-связывающие, а также спектральные характеристики изолированной цитохромоксидазы;
- роль альтернативной (цианиднечувствительной) терминальной оксидазы в
энергетическим метаболизме дрожжевых клеток.
Научная новизна полученных результатов, 'оказано, что различные химические реагенты, формирующие ковалентные сшивки в белках митохондрий и, тем самым, ограничивающие возможность их конформационных перестроек, незначительно влияют на скорость транспорта электронов а дыхательно.! цепи, но существенно снижают ее" способность к трансмембранному (электрогенному) переносу протонов; в условиях ограниченного протеолиза митохондрий, не затрагивающего барьерную функцию внутренней мембраны и не влияющего на скорость дыхания, энергозаласающая (протонпереносящая) функция электронтранспортной цепи блокируется.
Установлено, что митохондрии способны накапливать АТФ за счет энергии белковых конформационных перестроек,.инициированных серией темпераіурньїх уларов "О - +25 'С" в условиях, когда отсутствуют окисляемые субстраты и электротранспорта» цепь заингибнрована.
Обнаружено, что параметры взаимодействия лиіанд-свяіьіваюіцсго центра цитохромоксидазы міггохондрий с ингибитором, а также термоустончнвость белковых электронтранспортных ансамблей внутренней мембраны существенно модифицируются ее осмотической напряженностью.
4 Впервые показано, что функциональная активность как мембраносвязанноіі, так и
изолированной цнтохромоксидазы, заингибированных цианидом, восстанавливается при
облучения видимым ситом.
Выявлены выраженные cr-ектратные тиснения у цианидного комплекса изолированной цитохромоксидазы, а также ее окислеНной свободной формы после кратковременного светового воздействия; фотоиндуцированные перестройки спектров поглощения цитохромоксидазы обратимы и затухают а темноте в минутном диапазоне времени.
АТФ в физиологических концентрациях, незначительно влияя на спектральные свойства изолированной цитохромоксидазы, оказывает выраженное стимулирующее действие на ев каталитическую активность и резко изменяет параметры взаимодействия с ингибитором, лигандом активного центра фермента - цианидом.
Показано, что альтернативная терминальная оксндаза дыхательной цепи дрожжевых клеток в условиях де+ицита источников энергии и кислорода существенно повышает эффективность утилизации микроколнчеств экзогенных окисляемых субстратов и выживаемость клеток.
Впервые установлено, что в условиях продолжительного дефицита энергетических субстратов функцию синтеза АТФ у дрожжевых клеток способна выполнять их "наружная" Н -АТФаза путем обращения реакции за счет энергии высокого концентрационного градиента протонов на плазматической мембране.
Практическая значимость полученных результатов. Полученные данные имеют существенное значение для выяснения молекулярных механизмов сопряжения в процессах мембранного фосфорилирования и для разработки мет їв медикаментозной и физиотерапевтической коррекции патологических состояний человека, связанных с нарушениями клеточного дыхания и энергетического метаболизма.
Экономическая значимость полученных результатов. Выявленные закономерности процессов трансформации энергии в сопрягающих мембранах могут быть использованы в коммерческих проектах по созданию новых, высокоэффективных и экологически безопасных источников энергии.
Основные положения диссертации, выносимые на зашиту:
-
Генерация протонного градиента, но не транспорт электронов, связана с конфирмационными перестройками энерголреобразующих белков сопрягающей мембраны митохондрий.
-
Энергия термоиндуцированных белковых конфирмационных перестроек может использоваться для накопления АТФ митохондриями в отсутствие переноса электронов в
дыхательной цепи и трансмембранного градиента протонов.
3, Класс реакций фотоиндуцированной диссоциации "гемсодержащнй белок - лигаид"
включает в себя также и реакцию фотодеблокирования функциональной активности
цианидного комплекса мембраносвязанной, либо изолированной цитохромоксндазы.
4. Альтернативная терминальна* оксидаза дыхательной цепи дрожжевых клеток
существенно повышает эффективность утилизации энергии окисляемых субстратов в
условиях их дефицита.
Личный вклад соискателя. Выбор научной проблематики, объектов и методов исследования, условий экспериментов, анализ полученных результатов и их интерпретация выполнялись автором самостоятельно. Экспериментальный материал получен при решающем участии соискателя.
Апробация результатов диссертации. Основные материалы диссертации были доложены на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (август 1982, Москва), заседании Московского Общества испытателей природы (июнь 1986, Москва), Всесоюзной конференції "Структурная динамика биологических мембран и её роль в регуляции фото-биологических и рецепторных процессов" (май-июнь 1988, Минск), 1-ом и 2-ом Съездах белорусского общества фотобиологов и биофизиков (ноябрь 1994, июнь 1996, Минск).
Опуб.п.^ованность результатов. По теме диссертации опубликовано 23 научные работы (19 статей и 4 тезиса докладок).
Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, трех глав, включаюших постановку задачи (обзор литературы), результаты и их обсуждение, выводов, списка цитируемой литературы (%Чі наименований) и приложения (материалы и методы исследования). Работа изложена наЗ-ЭЧ страницах и содержит 61 рисунок и 5 таблиц.
Принятые сокращения. АТФ - аденозин-5'-трифосфат; БГК - бен згидроксамовая кислота; ГА - глутаровый альдегид; ДМС - диметилсуберимидат; ДСП - дитио-бнс- сук-цинимидилпропионат; ДТБП - диметил-3,3'-дигио-бис-пропионимидат; ДТТ - днтнотрейтол; ДЦКД - Нг<Г-дициклогексилкарбодиимид; М-Фі - медь- фенантролиновый комплекс (1,10-фенантролин и CuS04 в соотношении 2:1); ТМФД - Ы.г^'.г-Г-тетраметил-п-фенилендиамин; ТФФ - тетрафенилфосфоний; ХКФ - карбонилциання-т-хлорфенилгидразон; ЦО -цитохром-с-оксидаза; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; ДцН-t- - электрохимический градиент протонов; Af- мембранный потенциал; ЭТЦ - электронтранспортная цепь.