Введение к работе
1. Актуальность проблемы. "Зависят ли пространственная структура и конформационные параметры ДНК от нуклеотидной последовательности и, если зависят, то как?" - это фундаментальный вопрос, который интересует исследователей еще со времен открытия структуры Двойной Спирали ДНК Уотсоном и Криком в 1953 году. Ответ на этот вопрос является чрезвычайно важным, поскольку изменения в структуре ДНК в свою очередь могут участвовать в процессе биологического узнавания, то есть влиять на взаимодействия ДНК с белками и лигандами.
Детальное исследование пространственной структуры ДНК стало возможным только в последние 15 лет в значительной степени благодаря возможности синтезировать олигонуклеотиды с заданной последовательностью. Благодаря этому были закристаллизованы и методом рентгеноструктурного анализа расшифрованы пространственные структуры нескольких десятков двухцепочечных олигонуклеотидов. Успехи спекгроскопии ЯМР высокого разрешения позволили определить трехмерную структуру ряда олигонуклеотидов в растворе. Важную роль в определении пространственной структуры играют расчетно-теоретические методы молекулярной механики и молекулярной динамики. В настоящее время их использование стало составной частью методик построения молекулярных моделей по результатам данных, полученных с помощью методов ЯМР и рентгеноструктурного анализа.
Ко времени начала выполнения нашей работы в литературе накопилось много экспериментальных данных об особенностях свойств разных нуклеотидных последовательностей, не имевших объяснения в терминах тонкой структуры двойной спирали. Хотя факт зависимости ее конформации от последовательности был твердо установлен в рентгеноструктурных исследованиях волокон полинуклеотидов и кристаллов олигонукпеотидных дуплексов, остаются не ясными многие детали такой зависимости и возникает вопрос, не является ли эта
зависимость следствием межмолекулярных взаимодействий в кристаллах. Не были понятны причины аномальности свойств участков ДНК, содержащих только степы А-А, Т-Т и А-Т (но не Т-А). Вопрос о закономерностях и причинах возникновения изгибов двойной спирали широко обсуждался, но не был решен.
Хотя в центральной части дуплекса d(CGCGAATTCGCG) в кристалле Дикерсоном (Dickerson et al., 1981) было обнаружено упорядоченное образование из молекул воды, названное "водным хребтом", роль этого хребта в стабилизации аномальной В-конформации и возможность его возникновения в растворах не была установлена. Методом ЯМР были исследованы несколько олигонуклеотидных дуплексов, но методика исследования зависимости конформации двойной спирали от нуклеотидной последовательности не была отработана. Решению этих задач и посвящена диссертация.
2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение методом ЯМР и расчетно-теоретическими методами пространственной структуры ДНК и ее зависимости от нуклеотидной последовательности. В ходе проведенной работы были решены следующие задачи:
1. Определение, методом молекулярной механики с использованием данных
ЯМР, структуры (dA)n:(dT)„ фрагментов дуплексов в растворе и уточнение
структуры poly(dA)-poly(dT) в волокнах.
2. Исследование, методами Монте-Карло и молекулярной динамики,
зависимости структуры гидратнои оболочки гликозидного желоба ДНК от
нуклеотидной последовательности и конформации. Изучение роли водного хребта
Дикерсона в образовании аномальной конформации участков ДНК, содержащих
степы А-А, Т-Т и А-Т.
-
Построение модели изгибов оси спирали ДНК, содержащих АЯ-участки, и модели дуплекса d(GAATTTAAATTC)2 в растворе, объясняющей целый ряд экспериментальных данных.
-
Определение зависимости структурных параметров ДНК в растворе от последовательности.
3. Научная новизна работы.
Впервые, методом молекулярной механики с использованием данных ЯМР, определена пространственная структура (dA)n:(dT)„ -фрагментов дуплексов в растворе. Проанализированы различные факторы, которые могут определять структурные черты этих участков, и показано, что именно вода в гликозидном
желобе ДНК может играть существенную роль в формировании аномальной конформации с зауженным желобом.
Впервые, на основании расчетов, показана зависимость структуры гидратной оболочки гликозидного желоба от его ширины и нуклеотидной последовательности.
На основании построенной структуры (dA)n:(dT)n -фрагментов предложена модель изгибов оси спирали ДНК, содержащей А/Г- участки. Эта модель позволила обьяснить и предсказать целый ряд экспериментальных результатов. Определенная методами ЯМР и молекулярной динамики структура d(GAATTTAAAATTC)2 в растворе находится в хорошем согласии с предложенной моделью изгибов.
Впервые разработан и применен оригинальный подход к извлечению информации о структуре двойной спирали ДНК в растворе из сравнения ЯМР-спектров различных олигонуклеотидов, который позволяет избежать проблем, возникающих в процессе восстановления трехмерной структуры нуклеиновых кислот по данным спектроскопии ЯМР. Благодаря этому подходу впервые удалось с полной определенностью установить сам факт наличия связи между нуклеотидной последовательностью и структурой ДНК в растворе. Впервые выявлены межпротонные расстояния, характеризующие зависимость конформации двойной спирали от нуклеотидной последовательности.
4. Практическая ценность. Исследования, проведенные в ходе работы над
диссертацией, позволяют сформулировать новые теоретические представления о
зависимости конформации двойной спирали ДНК от нуклеотидной
последовательности и о проявлениях этой зависимости в экспериментальных
данных. Выявленные в диссертации корреляции между нуклеотидной
последовательностью и структурой ДНК в растворе могут быть использованы при
построении моделей биологического функционирования ДНК.
Закономерности, связывающие изменения конформационных параметров с нуклеотидной последовательностью ДНК, могут использоваться для предсказания пространственной структуры ДНК с определенной последовательностью, а также структуры комплексов ДНК с лигандами.
5. Апробация работы^ Результаты работы докладывались на:
-институтских семинарах и годовых конференциях НИВЦ АН СССР (ИМПБ
РАН);
-Симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и в клетке", Пущино 1985;
-Международном симпозиуме по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома, Тбилиси 1987;
-Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот, Брно, Чехословакия 1988;
-Международном симпозиуме по изгибам ДНК, Кембридж, Великобритания 1988;
-Седьмом Международном совещании по биомопекулярной стереодинамике, Олбани, США, 1989;
-Гордоновской конференции по нуклеиновым кислотам, Ньюпорт, США 1990;
-Восьмом Международном совещании по биомолекулярной стереодинамике, Олбани, США, 1991;
-Советско-Германском симпозиуме "Белково-нуклеиновые взаимодействия: структурные и фармакологические аспекты", Ленинград, 1991;"
6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 статей в ведущих международных журналах.
Диссертация состоит из трех глав и изложена в форме научного доклада.