Введение к работе
Актуальность темы. Первые опыты по ренатурации белка (рибонуклеазы) in vitro, проведенные Анфинсеном более 30 лет назад позволили предположить, что вся информация необходимая для приобретения белком уникальной структуры хранится в его первичной последовательности. Позднее это было подтверждено на ряде других белков. Однако в последнее время появляется все больше фактов, свидетельствующих о том, что не все белки способны приобретать жесткую структуру без помощи внешних помощников. Около 20-и лет назад было открыто семейство белков, названных шаперонами, которые связывают ненативные конформации белковых цепей и промотируют их сворачивание как in vivo, так и in vitro. Это явилось одним из существенных аргументов, ставящих под сомнение основной принцип самоорганизации белков, утверждающий, что вся необходимая и достаточная информация для сворачивания белка заложена в его аминокислотной последовательности. Именно это обстоятельство вызвало повышеный интерес к исследованию физико-химических свойств шаперонов.
Одним из наиболее интенсивно исследуемых представителей семейства шаперонов является белок теплового шока GroEL иэ E.coli. Способность GroEL пррмотировать правильное сворачивание других белков делает привлекательным его использование в биотехнологии для реактивации вновь синтезируемых белков из "тел включения", образование которых часто сопровождает экспрессию генов в чужеродных клетках. Сложная олигомерная организация структуры GroEL, наличие целого ряда субстратов, участвующих в осуществлении его функции, затрудняет выяснение механизма его участия в процессе сворачивания белков. В этой связи возникает ряд вопросов, ответы на которые могут внести ясность во взаимосвязь функции GroEL с его структурной организацией. К таким вопросам относятся, в частности, выяснение стабильности и конформационной подвижности GroEL по отношению к изменению условий внешней среды (температуры, рН, концентрации денатурантов) и наличию субстратов, выяснение природы внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих внутри- и межсубъединичную структуру GroEL. Определение диапазонов изменения внешних условий, при которых GroEL сохраняет свою структуру и функцию, является важным для использования GroEL в реактивации вновь синтезируемых белков из "тел включения", которые обычно растворяются при экстремальных внешних условиях (экстремальные рН и концентрации денатурантов).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование изменения кокформации и стабильности GroEL в растворе при изменении условий внешней среды (присутствие функционально важных субстратов, изменение температуры, рН и концентрации денатурантов).
Научная новизна. Впервые подробно исследована устойчивость структуры GroEL в широком интервале изменения внешних условий (концентрации денатуранта, рН раствора и температуры) и показано наличие широкомасштабных конформационных изменений GroEL при его связывании с субстратами.
Практическая ценность. Проведенные в работе исследования с одной стороны позволяют приблизиться к пониманию природы субстрат-зависимого функционирования GroEL как молекулярного шаперона, участвующего в процессе созревания белков в клетке, а с другой стороны представляют интерес с точки зрения использования GroEL в биотехнологии при реактивации вновь синтезированных белков из "тел включения", часто образующихся при суперэкспрессии генетического материала в чужеродных клетках.
Апробация работы и публикации. Основные результаты работы докпадовались на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (1994, 1995, 1996). По теме диссертации опубликовано три работы, и одна принята к печати.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, глав,