Введение к работе
Актуальность темы. Современное состояние исследований проблемы сворачивания белка не только позволяет сделать вывод о поэтапном механизме данного процесса, по и обеспечивает исследователя набором структурных характеристик промежуточных состояний, возникающих на пути сворачивания белка. Изучение различных физиологических процессов в клетке свидетельствуют о том, что для выполнения целого ряда функций молекуле белка необходимо принимать конформацию, отличную от нативной. Выдвинутое в 1988 году Бычковой и соавторами (Bychkova et al, 1988) предположение о том, что состояние расплавленной глобулы, наряду с другими негативными состояниями белка, может существовать в живой клетке и может быть вовлечено в целый ряд физиологических процессов, было экспериментально подтверждено в течение последних 10 лет. Так, было показано, что ненативное состояние белковой молекулы участвует в распознавании белка шаперонами (Martin et al., 1991; Van der Vies et al., 1992), проникновении белка в мембрану (Van der Goot et al., 1991; Van der Goot et al., 1992), передаче белком лигандов (Bychkova et al., 1992) и некоторых других процессах (см. также Bychkova & Ptitsyn, 1993 и Ptitsyn, 1995). Возникает вопрос - под действием каких факторов может происходить денатурация белка в живой клетке? Некоторые условия в клетке, такие как низкие рН (4.5-5.0) в лизосомах или около отрицательно заряженных мембранных поверхностей, наличие мембран и цитоскелета являются умеренно-денатурирующими условиями для белков. Мембранная поверхность с сильным электростатическим потенциалом притягивает протоны, что вызывает локальное понижение рН по крайней мере на 2 единицы на расстоянии 5-15А от поверхности мембраны (Eisenberg et al, 1979), способное дестабилизировать на-тивную структуру белка. Однако для большинства белков подобное понижение величины рН недостаточно для кислой денатурации белка. Поэтому было выдвинуто предположение о дополнительном денатурирующем воздействии поверхности мембраны - локальном понижении диэлектрической проницаемости и, как следствие, усилении электростатических взаимодействий вблизи ее поверхности (см. Bychkova & Ptitsyn, 1993; Ptitsyn, 1995)
Цель настоящей работы: - экспериментальная проверка предположения о том, что под влиянием умеренно низких значений диэлектрической постоянной и
рН нативный белок может быть денатурирован в живой клетке. Исследовались конформационные переходы в ало- и холо-цитохроме с и ретинол-связывающем белке в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН.
Научная новизна. Предполагаемое денатурирующее действие мембранных поверхностей на глобулярные белки, состоящее в одновременном воздействии двух факторов - понижении эффективной диэлектрической проницаемости воды вблизи органической поверхности и локальном понижении рН вблизи отрицательно заряженной поверхности - бьшо смоделировано в водно-спиртовых смесях при умеренно низких рН. Бьшо показано, что цитохром с и ретинол-связывающий белок в условиях умеренно низких значений диэлектрической постоянной и рН переходят в денатурированное состояние, обладающее всеми свойствами состояния расплавленной глобулы. Показано, что совместное действие этих двух факторов способно приводить к отдаче ретинол-связьшающим белком ретинола (витамина А), моделируя тем самым функцию данного белка - его участие в транспорте гидрофобного лиганда. В то же время апоцитохром с претерпевает в данной модельной системе переход из полностью развернутого состояния в некомпактное состояние, характеризующееся высоким содержанием вторичной структуры; данное состояние близко по своим структурным свойствам к состоянию апоцитохрома с, компетентному к транслокации через мембрану (de Jongh et al, 1992).
Апробация работы и научные публикации. Материалы диссертации докладывались на 23 Международном симпозиуме ФЕБО (Базель, Швецария, 1995), втором международном семинаре «Principles of Protein Architecture» (Токио, Япония, 1995), симпозиуме «Advances in Gene Technology: Biomolecular Design, Form and Function» (Лодердель, Флорида, США, 1997), Кейстоунском симпозиуме «Molecular and Cellular Biology: Protein Folding, Modification and Transport in the Early Secretory Pathway» (Taoc, Нью Мехико, США, 1997), на ежегодной научной конференции Института белка РАН, 1995 год, Пущино (Московская область). Стендовые сообщения были представлены на 2-ой Городской научной конференции молодых ученых, 1997 год, Пущино (Московская область) и на международном симпозиуме «Protein Strusture, Stability and Folding: Fundamental and Medical Aspects» (Москва, 1998); работа прошла апробацию на научных семинарах в Институте белка и Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН
(Пушино). Основные результаты работы, представленной к защите, отражены в 9 публикациях, в том числе в 4 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из "Введения", пяти глав, "Заключения", "Выводов" и "Списка литературы". Во "Введении" дано краткое описание задач и результатов исследования. Глава 1 посвящена описашпо и анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований в области сворачивания белка, возможности возникновения и функционального значения ненативпых конформаций белка в клетке. В главе 2 дано описание используемых методов и материалов. Главы 3, 4, и 5 посвящены описанию и анализу полученных результатаов. В главе 3 рассматриваются свойства молекулы цитохрома с в условиях, моделирующих окружение белка вблизи поверхности отрицательно заряженной мембраны. Глава 4 содержит результаты исследований структуры апо-формы цитохрома с в аналогичной модельной системе. В главе 5 описано применение данного модельного подхода к исследованию копформаци-онных превращений в молекуле ретинол-связывающего белка. Раздел "Заключение" содержит основные итоги данной работы. В конце диссертации приведены основные выводы из данной работы. Материал иллюстрирован 22 рисунками и 3 таблицами. Список цитируемой литературы включает 131 работу.