Введение к работе
.„.і I
-.-'----А^Фщльность проблемы. Одной из наиболее важных проблем в лучевой терапии злокачественных новообразований и радиобиологии является проблема преодоления резистентности гипоксических клеток опухолей к действию радиации. Гипоксические клетки, содержащиеся практически ео всех исследованных солидных опухолях, более резистентны к действию радиации, чем нормально оксигени-рованные клетки тканей, и в настоящее время считают, что именно присутствие радиорезистентных гипоксических клеток в опухоли является основной причиной, ограничивающей эффективность радиотерапии опухолей. Поскольку гипоксические клетки содержатся преимущественно в опухолях и практически отсутствуют в нормальных тканях, имеются условия для избирательной радиосенсибилизации опухолей. Существует несколько способов преодоления радиорезистентности опухолей - это фракционированное облучение, использование частиц с большими ЛПЗ, таких как нейтроны и протоны, применение гипербарического кислорода, гипертермия, гипергликемия и др. (Desher Е. , Gray L. , 1959, Ellis S. , 1967).
Но одни из этих способов не обеспечивают необходимого усиления радиационного поражения опухолей, другие не всегда возможно использовать из-за трудностей технической реализации (как, например, частицы с высоким значением ЛПЭ). Одним из наиболее перспективных и.доступных в настоящее время путей повышения эффективности радиотерапии опухолей является использование электроноакцепторных радиосенсибилизаторов гипоксических клеток, среди которых наиболее эффективными при использовании в экспериментальной и клинической радиотерапии оказались производные нитроимидазолов (J. С. Asquith et. al. , 1974; R. L. Villson et. al., 1974, &E. Adams et. al., 1984, Пелевина И. И. и co-авт. ,1978, Рябченко R И. и соавт. , 1982, Киселева Е. С., Дарь-ялова С. Л..І984, и др.). Но использование исследованных соединений в клинике ограничено или недостаточной степенью радиосенсибилизации, или высокой токсичностью, поэтому актуальными остаются поиск и создание соединений с более выраженными радиосенс ибилизируюсими свойствами и меньшей токсичностью. Для целенаправленного поиска таких соединений необходимо знание молекулярных механизмов их биологического действия И ТЄХ FJ!-"T04HblX событий, которые е наибольшей степени ответственны за повышение
- 2 -радиочувствительности гилоксических клеток.
В настоящее время имеется большое количество исследований по совместному действию радиации и нитросоединений на гипокси-ческие клетки (G. Е. Adams et. al., 1976; P. W. Sheldon et. al. , 1974; К. И. Пелевина и др. , 1978, 1984; Н.И. Рябченко, 1985; J. М. Brown, 1985) и по цитотоксическому действию нитроимидазолов СЕ. J. Hall et. al., 1975; A.J. Varghese et. al. , 1976; J. E. Biaglow et. al. , 1986). Но молекуляоные механизмы сочетанного действия радиации и нитросоеяинений остаются во многом неясными. Мало информации имеется о механизмах совместного действия этих факторов непосредственно на опухоли животных. Практически отсутствует информация о влиянии нитросоединений на первичные радиационные свободнорадикальные повреждения клеточных компонентов, которые являются инициаторами развития дальнейших повреждений в клетке.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярных механизмов радиосенсибилиэирующего.действия нитросоединений, а также путей биотрансформации их в организме животных и влияния на метаболические процессы в тканях опухолей и органов животных. В качестве основных задач исследования были поставлены следующие:
-
Изучить методом низкотемпературной ЭПР спектроскопии влияние электроноакцепторных нитросоединений на первичные ради-ационно-индуцированные повреждения клеточных компонентовтканей опухолей и органов животных, для чего провести сравнительный .анализ относительных выходов радикалов биомакромолекул в тканях после введения животным нитросоединений и без введения.
-
Методами ЭПР и 31-Р ЯМР изучить изменения метаболических процессов в тканях опухоли и органов животных при совместном действии нитросоединений и радиации.
3. Изучить клеточные мишени действия ряда нитрофуранов,
нитроимидаголов и других нитросоединений.
4. Изучить методом ЭПР пути биотрансформации нитрофуранов
и нитроимидазолов -в организме животных.
Б. Установить новые аспекты молекулярного механизма радио-сенсибилизируюшего действия нитросоединений.
Научная новизна В работе получены новые данные, вносящие
- з -существенный вклад в понимание молекулярных механизмов радио- сенсибилизирующего действия нитросоединений, путей биотрансформации этих соединений в организме животных и влияния их на метаболические процессы в тканях опухолей и органов животных. Впервые сделан вывод о радиационно-индуцированном усилении цитотоксического действия нитроимидаэолов как основном факторе в механизме их радиосенсибилизирующего действия.
Впервые показано, что при облучении тканей опухоли и органов животных в присутствии нитроимидаэолов образуется значительное количество анион-радикалов нитрогрулпы этих соединений,' при этом снижается выход радиационных повреждений биомакромоле-кул клетки. Установлено соотношение между относительными выходами радиационно-индуцированных радикалов биомакромолекул клеток, анион-радикалов нитроимидазолов и гидроксильных радикалов. Показано, что присутствие миэонидазола в тканях приводит к преимущественному снижению выхода радиационно-индуцированных радикалов Н-аддуктов тимикоеых оснований ЛКК и лилидных компонентов мембран. Установленное снижение уроєня радиационйо-индуцированных радикалов биомакромолекул в тканях с нитроимидазолами, образование при этом значительного количества анион-радикалов нитроимидаэолов, а также увеличение в облученной опухоли с кит-роимидазолами содержания китрозильных комплексов гембелков свидетельствуют о том, что основным фактором в механизме радиосенсибилизирующего действия нитросоединений является радиационно- индуцированное усиление цитотоксического действия этих соединений за счет увеличения содержания продуктов неполного восстановления нитрогруппы. Линамика накопления и интенсивность сигналов ЭПР нитрозильных комплексов гембелков в тканях опухолей при совместном действии радиации и препаратов могут быть использованы при оценке радиосенсибилизирующих свойств нитросоединений. Впервые показано, что нитроимидазолы приводят к увеличение выхода радиационно-индуцированных радикалов аскорбиновой кислоты, что может явиться важным вкладом в понимание механизмов радиосенсибилизирующего и цитотоксического действия нитроимидазолов.
Впервые установлено, что нитроимидазолы, нитрофураны, нитроглицерин в организме животных и в гомогенатах тканей подвер-
гаются биотрансформации с образованием оксида азота, о чем свидетельствует появление в спектрах ЭПР тканей органов и крови животных в первые часы после введения этих соединений интенсивных сигналов ЭПР нитроэильных комплексов Гем-NO и Fe-S-NO. Установлено, что введение мизонидазола приводит к ингибированию рибонуклеотидредуктазы - фермента, играющего важную роль в синтезе ДНК.' Впервые изучены изменения энергетического метаболизма тканей опухоли при совместном действии мизонидазола и радиации и показано, что облучение усиливает токсическое действие мизонидазола, связанное с нарушением энергетического метаболизма клеток.
Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят существенный вклад в развитие представлений о молекулярных механизмах действия радиосенсибилизаторов гипоксических клеток опухолей и могут быть использованы при разработке новых соединений для радиотерапии опухолей и прогнозирования их эффективности.
Предложенные и обоснованные в диссертационной работе аспекты молекулярных механизмов радиосенсибилизируюшего действия электроноакцепторных нитросоединений, основанные на эффекте ра-диационно-индуцированного усиления цитотоксического действия этих соединений, являются теоретическим обоснованием путей поиска и создания новых, более активных и менее токсичных. ( по сравнению с используемыми в клинике нитроимидазолами) соединений для повышения эффективности лучевой терапии опухолей.
Разработанные методические подходы, основанные на регистрации методом ЭПР анион-радикалов нитросоединений и нитроэильных комплексов гемсодержащих белков Гем-NO в опухоли при совместном действии нитросоединений и радиации, могут быть использованы на практике при отборе и проверке эффективности новых радиосенсибилизаторов для лучевой терапии опухолей.
Способ регистрации методом ЭПР радиационно-индуцированных анион-радикалов нитрогруппы может быть использован для изучения' распределения нитросоединений в организме, динамики накопления и выведения их из тканей органов и крови животных.
Результаты работы использованы-в монографии М. К.' Пулато-вой, Г. Т. Рихиревой, 3. В. Куроптевой "Электронный парамагнитный
' - 5 -резонанс в молекулярной радиобиологии", Москва: Энергоатомиз-дат, 1989.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались: на Всесоюзной конференции "Радиомодификаторы в лучевой терапии опухолей" (Обнинск, 1982), на 8 Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевом поврежде-нии'ЧЛенинград, 1982), на 14 Ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды (Москва, 1984); на Всесоюзной конференции "модификация радиочувствительности в экспериментальных условиях" (Фрунзе, 1986); на Всесоюзных конференциях "магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1985, 1989, 1990); на 19 Ежегодном совещании европейских сбоїеств ра-диобиологоов (Прага, 1985); на Всесоюзном совещании "Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей" (Черноголовка, 1987); на I Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987); на 4 рабочем совещании по радиационным взаимодействиям (Лейпциг, 1987), на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989); на 22 Всепольском семинаре "Ядерный магнитный резонанс и его применения" (Краков, 1989); на конкурсах научных работ Ш> АН СССР (1987,.1989, 1990); на Рабочем совещании по исследованию механизмов радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК (Дубна, 1990); на Всесоюзной конференции "Метаболические нарушения и их коррекция в онкологии" (Москва, 1991); на 9 Международном Конгрессе по радиационным исследованиям (Торонто, Канада, 1991), на 17 Греевской конференции (Кантербури, Великобритания, 1992).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 39 печатных работах.
На защиту выносятся:
-
Эффект образования оксида азота в результате восстановительной Сиотрансформации нитрофуранов, нитроимидазолов и ряда других нитросоединений.
-
Эффект образования анион-радикалов' Нитрогруппн при биотрансформации нитросоединений в тканях животных и при облучении тканей с введенными нитросоединениями.
-
Вывод о снижении выхода радиационно-индуцированных ра-
- б -
дикалов биомакромолекул клеток в тканях опухолей и органов животных после ьеєдєния нитроимидазолов.
-
Вывод о преимущественном снижении в тканях с мизонида-эолом выхода радиационно-индуцированных радикалов Н-аддуктов тиминовых оснований ДНК, радикалов жирнокислотных остатков ли-пидов и радикалов разрыва сложноэфирных связей в фосфолипидах и триацилглицеринах.
-
Вывод о радиационно-индуцированном повышении в опухоли содержания токсичных продуктов неполного восстановления нитро-соединений и о радиационном усилении токсического действия нит-росоединений на ткани опухоли.
-
Эффект увеличения выхода радиационно-индуцированных радикалов аскорбиновой кислоты в тканях опухоли, печени и мозга животных под действием мизонидазола.
-
Вывод о том, что основным фактором в механизме радио-сенсибилизирующего действия нитросоединений является индуцированное действием радиации увеличение в опухоли с нитросоедине-ниями токсичных и высокореакционных продуктов неполного восстановления нитрогруппы - нитрозо- и гидроксиламинопроизводных, которые и обеспечивают радиосенсибилизирующ?е действие этих соединений.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава посвящена краткому обзору состояния изучаемой проблемы с обоснованием постановки задач исследования. Описние экспериментальных методик содержится во второй главе. Третья, четвертая, пятая и шестая главы содержат результаты экспериментальных исследований, каждая из них заканчивается заключением с суммированием основных полученных данных. В заключении к диссертации суммированы общие итоги всей работы и перечислены основные выводы. Общий объем диссертации составляет 255 страниц. Экспериментальный материал представлен на 58 рисунках и- в 8 таблицах. Список литературы включает 275 работ отечественных и иностранных авторов.