Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы в исследованиях по культуре тканей и клеток высших растений четко наметились два основные тенденции. Первое из них связано с углубленным исследованием биологии культивируемой растительной клетки, изучением особенностей ее метаболизма, роста, дифференцировки, присущей ей генетической и эпигенетической изменчивости. Второе направление прикладное, ставящее своей целью возможно более широкое использование приемов и методов культуры тканей и клеток для решения трудных практических задач, возникающих в растениеводстве, сельскохозяйственной генетике и селекции.
Одним из таких весьма эффективных и экономически выгодных приемов является клональное микроразмножение растений в культуре in vitro. Этот метод позволяет за короткий срок получать большое количество однородного посадочного материала. Коэффициенты микроразмножения достигают 10-10 растений в год, что в десятки тысяч раз больше, чем при использовании традиционных методов вегетативного размножения. Кроме того, в последнее время предпринимаются попытки использования клеточных культур для уменьшения загрязнения среды, производства энергии, получения белков, медицинских препаратов и т.п.
Совершенствование методов культивирования клеточных культур и разрабатываемые в последние годы методы генетической трансформации клеток открывают новые многообещающие пути для их более значительного промышленного использования.
Дія успешного решения вышеприведенных задач необходимо:
а) провести отбор наиболее удобного растительного материала;
б) исследовать возможность получения длительно пассируемых кле-
. точных культур и определить основные параметры ее роста в процессе культ ив ирования;
в) исследовать консервативную способность культуры к сохранению
патогенетических особенностей сорта;
г) провести подбор наиболее оптимальных питательных сред;
д) исследовать изменение гормонального статуса в процессе культи
вирования.
Общим недостатком исследований, проводимых в данном направлении является отсутствие комплексного подхода, что не позволяет всесторонне исследовать рост конкретной клеточной культуры. По-
- 4 -давляющее большинство исследований, проводимых в этом направлении генетиками и физиологами, осуществляется без привлечения пре-цеззионных методов биофизики и математической биологии. Со своей стороны методы популяционной математики и клеточной биофизики в основном используются при исследовании параметров роста бактериальных культур в реакторах прерывистого и непрерывного действия. Кроме того, практически не учитываются как генетические особенности исследуемого сорта, так и генетические особенности родительских форм гибридов. Зачастую не учитывается также гормональная чувствительность конкретных источников клеточных культур, и в средах инкубации используются концентрации фитогормонов, рекомендуемых вообщем для данного вида.
Цель и задачи исследований. Учитывая вышеизложенное, а также чрезвычайную важность выявления любых аспектов роста и морфогенеза клеточных культур с целью дальнейшего использования в биотехнологии и селекции, в настоящей работе были поставлены следующие задачи.
I. Исследовать способность образования первичного каллуса из суспензионных культур клеток различных сортов пшеницы, а также способность данных каллусных тканей к морфогенезу и регенерации в различных средах.
. 2. Исследовать кинетические параметры роста клеточных культур различных сортов пшеницы как в первые 24 часа пассирования, так и на протяжении всего цикла роста биомассы суспензионной культуры, а также митотическую активность различных сортов.
-
Исследовать динамику размеров клеток, ядер и ядерно-плазменных отношений в цикле роста и в процессе пассирования суспензионных культур различных сортов пшеницы.
-
Провести сравнительный анализ гормональной чувствительности клеток суспензионных культур различных сортов пшеницы, а также исследование особенностей транспорта гиббереллина Ад в клеточные культуры различных сортов пшеницы.
Научная новизна и практическая ценность. На основании экспериментальных данных показано, что в процессе пассирования суспензионные клеточные культуры исследованных сортов пшеницы сохраняют свои морфогенетические потенции, что позволяет их использовать для всестороннего исследования и сравнительного анализа, в качестве исходного материала для соматической гибридизации и получения новых сортов. Выявлены особенности действия различных фитогормо-
- 5 -нов на формировании "зеленого" и "бесцветного" гетерогенных каллусов.
Обнаружено, что в первые 24 часа пассирования кривые роста суспензионных культур клеток можно описывать системами уравнений, обычно используемых для анализа роста бактериальных культур. Выявлено, что обычно используемые 24 часовые замеры не позволяют характеризовать особенности роста клеточных культур различных сортов из-за быстрого достижения стационарной фазы. Впервые предложен способ комплексного анализа генетических особенностей отдельных сортов на основании сравнения ряда параметров клеточного роста.
Впервые исследована динамика изменения площадей и объемов ядер и клеток, а также ядерно-плазменных отношений суспензионных культур пшеницы, во всем интервале между последующими пассированиями. Обнаружено, что после достижения стационарной фазы, ядерно-плазменные отношения достигают исходных величин.
Впервые исследован транспорт гиббереллина в клетки суспензионных культур различных сортов пшеницы. Выявлено, что число гиббереллин-связывающих сайтов различных сортов отличаются друг от друга. Обнаружено, что концентрация гиббереллиновых "рецепторов", а также параметры Кр и п в процессе образования клеточной культуры сохраняются. Показана различная концентрация гиббереллиновых рецепторов у различных сортов.
Выявление особенностей получения суспензионных клеточных культур различных сортов, а также особенностей их гормональной чувствительности, особенности роста в биореакторах, кинетика размножения, открывают широкие перспективы как для разработки рекомендаций для непосредственного внедрения в биотехнологию и сельхозпрактику, так и для поиска и получения новых сортов и гиб-ридом, обладающих повышенным сродством к фитогормонам.
На защиту выносятся следующие основные положения.
-
Получены стабильные, длительно пассируемые суспензионные культуры различных сортов пшеницы, сохраняющие свои морфогенети-ческие потенции в процессе пассирования. Показано, что регенера-ционная способность суспензионных культур, а также роста "зеленого" и "бесцветного" гетерогенных каллусов зависит от концентрации и соотношения основных фитогормонов.
-
На основе математических моделей роста прокариотических популяций предложена система комплексного анализа для характери-
зации роста суспензионных культур. Подобрана система параметров, позволяющая характеризовать, а также идентифицировать и проводить сравнительный анализ особенностей роста суспензионных культур клеток различных сортов пшеницы.
-
Морфоцитологический анализ на системе анализатора изображений "ibas-2" (Opton, ФРГ) позволил идентифицировать динамику изменений ядерно-плазменных отношений и размеров ядер и клеток.
-
Сравнительный анализ транспорта гиббереллина показал сохранение сродства к фитогормону в процессе образования суспензионных культур клеток с одной стороны, и неодинаковую фитогормон-чувствительность у разных сортов, с другой.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Ш Республиканской конференции "Достижения физико-химической биологии и биотехнологии в республике и пути их внедрения (Ереван, 1989), на научной конференции молодых ученых (Ереван, 1990), научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов университета (Ереван, 1991), на семинарах кафедры биофизики.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и принято к публикации 5 работ.
Объем работы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста и содержит 5 таблиц и 18 рисунков. Список использованной литературы включает 183 наименований, в том числе 131 зарубежных источников.