Введение к работе
Актуальность проблемы. Фотосинтез - важнейший природный процесс, лежащий в основе жизни на Земле, изначальный неточних энергии в биосфере. Уникальность этого процесса обусловлена прежде всего его первичными стадиями, в ходе которых энергия солнечного излучения с высокой эффективностью преобразуется в более стабильные, биологически приемлемые формы энергии. Среди разнообразного мира живой природы только фотосинтезирующие организмы - растения, водоросли, зеленые и пурпурные бактерии - имеют специальный аппарат для такого преобразования. Прочие организмы поддерживают свою жизнедеятельность, используя - прямо или косвенно - солнечную энергию, запасенную ранее при фотосинтезе. Выяснение физико-химических закономерностей первичных процессов фотосинтеза, помимо важного фундаментального значения, представляет интерес в прикладном аспекте, открывая возожность управления этим жизненно важным процессом, создает основы повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Не меньшее значение имеет и моделирование первичных стадий фотосинтеза, которое закладывает основы для создания экологически чистых источников энергии, быстродействующих запоминающих устройств и различных биотехнологических процессов, предназначенных для синтеза ценных органических веществ. Воника-ющая при этом главная проблема состоит в том, чтобы выяснить основные особенности структурной организации фотосинтетического аппарата и физических механизмов процессов, благодаря которым достигается высокоэффективное преобразование короткоживущей энергии фотоиндуцироваиных электронных возбужденных состояний в миллионы раз более стабильную энергию разделенных зарядов. Достигнутые в последние годы успехи поставили данную область исследований в ряд наиболее продвинутых разделов молекулярной биологии и биофизики. Среди выдающихся достижений следует упомянуть о выделении из Фотосинтетических мембран и кристаллизации препаратов реакционных центров (РЦ), (Reed, Clayton, 1968; Clayton, Wang, 1973; Michel et al., 1983). Рентгеноструктурные исследования одиночных кристаллов РЦ (Deisenhofer et al., 1934; Michel et al., 1986) позволяли выяснить детали пространственной организации пигмент-белкового комплекса (ПБК) РЦ, включая ближайшее водно-белковое окружение молекул - партнеров первичного разделения зарядов. Однако, очевидно, что даже детальное знание структуры системы недостаточно для выяснения механизмов ее функционирования. Весьма информативными в
этом отношении являются спектральные методы высокого временного разрешения (Борисов. 1986). Эти методы давно и успешно используются при изучении механизмов фотосинтеза в ряде лабораторий у нас в стране. (Ахманова, Борисова. Гуриновича, Красновского, Литвина, Матвееца, Масловаг Пискарскаса, Ребане, Рубина, Пащенко, Фрей-Серга, Чибисова, Шувалова и др.) и за рубежом (Duysens, Clayton, Parson, Zankel, Lavorel, Moya., Dutton, Rentzepis, Ke, Hoff, Windsor, Holzwarth, Sundstroo, Grondelle).
Характер протекания первичных процессов у разных фотосинте-зирующих организмов имеет свои специфические особенности, однако главные его закономерности весьма сходны (Шувалов, Красновский, 1983; Рубин и др., 1987). Универсальным является построение фотосинтетического аппарата из пигмент-белковых комплексов светосо-бирающей антенны (ССА) и реакционных центров. Функция первых состоит в поглощении квантов света и передаче энергии электронных возбужденных состояний на РЦ, где происходит преобразование энергии этих состояний в энергию разделенных зарядов. Сходство в организации первичных процессов у разных представителей мира фотосинтеза, определяемое общностью их главной функции - эффективного преобразования энергии света в энергию разделенных зарядов -- делает оправданным использование для выяснения фундаментальных закономерностей трансформации энергии наиболее просто организованных объектов, каковыми являются пурпурные бактерии. Первичные процессы бактериального фотосинтеза включают в себя: (1) поглощение света молекулами бактериохлорофилла (БХЛ); (2) миграцию энергии электронных возбужденных состояний между пигментами ССА; (3) перенос энергии от пигментов ССА на РЦ; (4) преобразование энергии электронных возбужденных состояний в энергию зарядов разноименного знака, разнесенных поперек сопрягающей внутриклеточной мембраны.
К началу выполнения данной работы (1970 г.) целый ряд важных деталей в механизмах протекания стадий (2)-(4) не был ясен. Спорным был вопрос об участии триплетних состояний пигментов в первичных процессах фотосинтеза. Относительно механизма разделения зарядов в РЦ общепринятым было представление, экспериментально обоснованное Красновским (1948 г.), согласно которому этот процесс пред-стазляет собой фотохимическую окислительно-восстановительную реакцию. Предполагалось, что первичным донором электрона в этом процессе является специальная пара БХЛ РЦ, Р870, а первичным акцептором - молекула убихинона Q (Clayton, Straley, 1970; Slooten,
1972; Cogdell et al., 1974). В растворах реакции такого рода протекают обычно через триплетное состояние пигментов (Чибисов, 1981) и отличаются невысоким квантовым выходом. В тех случаях, когда такие реакции протекают через синглетное возбужденное состояние, квантовый выход может достигать высоких значений, однако, образующиеся продукты нестабильны, рекомбинируя за десятки пикосе-кунд (Holten et al., 1976). Представлялось важным выяснить, какие особенности протекания первичного разделения зарядов в фотосинтетических РЦ обеспечивают квантовый выход этого процесса, не достижимый в растворах. Существовал и ряд вопросов принципиальной важности касательно механизмов стадий (2) и (3). Так, данные о путях, скоростях и механизмах гетерогенной миграции энергии в ССА пурпурных бактерий носили косвенный характер и были противоречивы. Не было полной ясности в вопросе о том, какие состояния молекул БХЛ ССА участвуют в переносе энергии к РЦ, каковы скорости и механизмы этого переноса. Важность перечисленных проблем для построения единой картины первичных процессов фотосинтеза и для выяснения общих закономерностей превращения энергии света в электрохимическую форму и определила задачи настоящей работы.
Цели и задачи исследований. Целью работы явилось выяснение принципов структурной и функциональной организации фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий, которые определяют высокую эффективность преобразования энергии света, а также физических механизмов последовательных стадий этого преобразования. В работе поставлены следующие конкретные задачи:
выяснить природу состояний, посредством которых осуществляется перенос энергии от ССА к РЦ;
изучить кинетические закономерности переноса энергии от пигментов ССА к РЦ, выяснить его механизмы и определить эффективность;
исследовать пикосекундную динамику электронных возбужденных состояний в спектрально гетерогенных ССА пурпурных бактерий, выяснить на этой основе топологию взаимного расположения различных ПБК в мембранах;
определить кинетические и энергетические характеристики промежуточных стадий в разделении зарядов в РЦ;
изучить роль пигмент-белковых взаимодействий в ходе первичного процесса преобразования энергии на ранних наносекунлных и пикосекундных стадиях;
воспроизвести в искусственной системе основное свойство фо-
тосинтетической CCA - малую скорость безызлучательных потерь при высокой локальной концентрации пигмента.
Научная новизна полученных результатов заключается в установлении ряда фундаментальных закономерностей преобразования энергии света в ходе первичных процессов бактериального фотосинтеза:
Обнаружена кинетическая неоднородность флуоресценции пурпурных бактерий, обусловленная спектральной и структурной неоднородностью фотосинтетического аппарата, а также наличием в ней компонентов разной природы: пикосекундной "фотосинтетической" флуоресценции; "фоновой" флуоресценции пигментов, не включенных в систему миграции энергии к РЦ; наносекундной рекомбинационнои люминесценции, источником которой являются РЦ с нарушенным переносом электрона на начальном участке фотосиктетической электрон-транспортной цепи.
В прямом опыте показано, что пикосекундная флуоресценция и фотохимический захват синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА реакционными центрами являются конкурирующими процессами. Данный факт непосредственно свидетельствует, что перенос энергии к РЦ в бактериальном фотосинтезе происходит посредством синглетных возбужденных состояний БХЛ.
Обнаружено, что закрытые РЦ тушат синглетные возбужденные состояния БХЛ ССА за пикосекундные времена, благодаря чему обеспечивается фотохимическая стабильность фотосинтетического аппарата.
Изучение пространственной, временной и энергетической организации процессов миграции энергии в спектрально гетерогенных
ССА пурпурных бактерий показало, что в них реализуется пикосе-кундный направленный от периферии фотосинтетической единицы (ФСЕ) к РЦ перенос энергии возбуждений. Важная роль в создании направленности переноса принадлежит выявленной методом флуоресцентной спектрохронографии спектральной неоднородности длинноволновых околоцентровых форм БХЛ. В результате, время и эффективность первичного разделения зарядов в изученных системах практически не зависят от размеров *СЕ.
- Необходимым фактором достижения высокого ( 98%) квантового
выхода разделения зарядов в фотосинтетических РЦ является вклю
чение в этот процесс промежуточных пикосекундных состояний, в
которые вовлечены молекулы порфириновой природы, входящие в со
став РЦ. Одним из проявлений существования таких состояний явля
ется наносекундкая люминесценция, которая возникает при рекомби
нации промежуточных продуктов в условиях, когда перенос электрона
из порфиринового комплекса РЦ на хинонные акцепторы ингибирован.
Стабилизация продуктов первичного разделения зарядов на пико-, наносекундных временах осуществляется при участии протонов водно-белковых водородных связей и связанной белком воды.
Генерируемый в результате работы фотосинтетической цепи переноса электрона мембранный потенциал является первичным регуляторним механизмом фотосинтеза, повышая вероятность рекомбинации промежуточных короткоживущих продуктов разделения зарядов в РЦ.
Научно-практическая значимость работы состоит, прежде всего, в установлении фундаментальных закономерностей, лежащих в основе организации в пространстве и во времени системы высокоэффективного светосбора от сотен молекул БХЛ на РЦ и последующего преобразования энергии синглетных возбужденных состояний в энергию разделенных зарядов. Выявленные закономерности могут послужить основой для создания искусственных систем, эффективно преобразующих энергию света в электрохимическую форму, для практических разработок в области молекулярной биоэлектроники. Обнаруженные особенности организации спектрально гетерогенных ССА могут быть использованы для создания светособирающих систем, которые поглощали бы свет в широком спектральном диапазоне, перекрывающем практически весь диапазон солнечного излучения, и эффективно передавали поглощенную энергию на центры ее преобразования.
Разработанный метод "временного рычага" используется для изучения быстрозатухающих двухкомпонентных свечений методом фазовой флуорометрии. Исследование наносекундной рекомбинаци-онной люминесценции используется для характеристики функционального состояния РЦ и начального участка цепи электронного транспорта у фотосинтетических бактерий, для изучения влияния на эффективность фотосинтеза таких факторов среды как температура, влажность, химические соединения типа гербицидов и т.д. .
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на 1 Всесоюзном симпозиуме "Проблемы биофотохимии" (г.Москва, 1970 г.), на 2, 5, 6 и 7 Международных конгрессах по фотосинтезу (г.Стресса, 1971 г.; г.Халкидики, 1980 г.; г.Брюссель, 1983 г.; г.Провиденс, 1986 г.), на 20, 21 и 26 Всесоюзных совещаниях по люминесценции (г.Сухуми, 1971 г.; г.Киев, 1975 г.; г.Самарканд, 1979 г.), на Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы трансформации световой энергии при фотосинтезе" (г.Москва, 1976 г.), на Всесоюзном семинаре по биофотонике (г.Пущино,
1977 г.), на Всесоюзной конференции "Быстропротехающие процессы преобразования световой энергии при фотосинтезе" (г.Москва, 1979 г.), на 4 и 5 Международных семинарах по переносу энергии в конденсированных системах (г.Прага, 1981 г. и 1985 г.), на 19-ом координационном совещании специалистов стран-членов СЭВ "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата" (г.Пущино, 1981 г.), на Всесоюзном семинаре "Механизмы превращения энергии при фотосинтезе" (г.Москва, 1982 г.), на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (г.Москва, 1982 г.), на Всесоюзной конференции по возобновляемым источникам энергии (г.Ереван, 1985 г.), на 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (г.Киев, 1985 г.), на 1-ом Европейском конгрессе по фотобиологии (г.Гренобль, 1986 г.), на 4-ой Всесоюзной школе "Применение лазеров в биологии" (г.Кишинрв, 1986 г.), на 2-ой Всесоюзной конференции "Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии" (г.Ленинград, 1987 г.), на Всесоюзной конференции "Физико--химическая биология и биотехнология фототрофных микроорганизмов" (г.Москва, 1987 г.), на Международном симпозиуме "Спектроскопия сверхбыстрых явлений" (г.Вильнюс, 1987 г.), на Рабочем семинаре "лазерная спектроскопия сложных молекул" (г.Таллин, 1988 г.), а также на научных семинарах Лаборатории им. А.Н.Белозерского МГУ, хафедр биофизики физического и биологического факультетов МГУ.
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 37 статьях, двух обзорах, а также тезисах перечисленных выше конференций .
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, изложение методов исследований, изложение экспериментальных результатов, занимающее 7 глав, заключение и выводы. Она изложена на страницах машинописного текста, содержит 59 рисунков и библиографический список цитируемой литературы, включающий наименований.