Введение к работе
Актуальность темы
Исследование состояния крови и ее отдельных компонентов, а также роли клеток крови и их гидродинамических свойств в процессах, влияющих на динвмику течения крови, имеет важное значение для развития диагностических методов в биологии и медицине.
Кровь по своему составу и свойствам составляющих ее элементов является сложной иногокомпонентной жидкостью. В зависимости от условий течения кровь может проявлять неньютоновские свойства, различные хикические и физические факторы вызывают изменение как состава крови, так и свойств отдельных клеток крови. Таким образом, изучение свойств движущейся крови, а также различных типов взаимодействия составляющих ее компонентов, влияющих на движение крови, является одной из наиболее сложных и важных задач биофизики.
Форменные элементы крови, к которым относятся эритроциты, тромбоциты и лейкоциты, составляют около 46% объема крови. В плазме в растворенном состоянии находятся различные белки, участвующие в иммунных реакциях, свертывании крови, агрегации клеток крови и т.д. Наиболее важными с точки зрения реологии крови япляются эритроциты в силу их специфических свойств и выполняемых ими в организме функций.
Особая форма эритроцитов (двояковогнутые диски) и упругие свойства мембраны этих клеток делает возможным их проникновение в капилляры меньшего диаметра, чем диаметр эритроцитов, что позволяет им осуществлять транспорт кислорода. Благодаря своей высокой концентрации и наличию в плазме адгезивных макромолекул белков эритроциты взаимодействуют между собой с образованием агрегатов, которые разрушаются под действием сдвиговых сил. Этот эффект оказывает значительное влияние на вязкость крови и характер течения крови в макро- и микрососудах
В экспериментах с клетками крови важными условиями являются бесконтактность и невозмущающее действие измерительной аппаратуры. Более всего отвечают этим требованиям оптические и, в частности, лазерные методы исследования [1J. Монохроматические источники света в широком диапазоне длин волн дают возможность подобрать оптимальные условия для исследования биологических 'объектов. Применение лазеров плзволяет создать направленные
сфокусированные пучки и, тем самым, уменьшить измерительный объем. Используемые в экспериментах с живыми объектами низкоинтенсивные лазеры, как правило, не вносят искажений в результаты измерений за счет изменения свойств объекта. Однако, опыт использования ниэкоинтенсивного лазерного излучения для терапии ряда заболеваний, в частности, путем облучения крови, говорит о том, что здесь необходимы дополнительные исследования [2].
Для оценки агрегациокных свойств эритроцитов используют методы регистрации излучения, рассеянного в направлении вперед или назад. Получаемый сигнал подвергается обработке с помощью различных алгоритмов, что дает возможность определить некоторые количественные параметры процессов деформации и агрегации
В агрегометрии разработаны два подхода к изучению агрегации красных клеток крови: путем регистрации излучения, прошедшего через тонкий слой крови в зазоре вискозиметра типа "конус-пластина", и рассеянного в направлении назад от слоя крови в зазоре вискозиметра типа Куэтта (Couette) или Серла (Searle).
Первый подход позволил путем микрофотосъемки зарегистрировать последовательные стадии процессов формирования и разрушения агрегатов в потоке, а также изучить особенности процесса агрегации в зависимости от вида, формы, концентрации и заряда адгезнрующего белка [Ц В системе такого типа (толщина зазора варьируется от 10 до 160 мкм) процесс агрегации заканчивается на стадии образования двумерных линейных агрегатов, что не дает возможности наблюдать образование крупных кластеров, характерных для некоторых заболеваний.
Другой подход был развит в работах [4,5]. Изучение поведения эритроцитов в течении Куэтта или Серла путем регистрации рассеянного назад света позволило интерпретировать процесс агрегации в терминах кинетик: и выделить структурные и реологические параметры эритроцитаркых агрегатов. Было показано, что такие количественные параметры чувствительны к изменению .температуры крови, концентрации эритроцитов и к наличию патологии Однако, выбор этих количественных показателей представляется необоснованным, так как они не связываются с реальными процессами, происходящими в крови.
Основной целью настоящей работы является научное обоснование методики измерения параметров агрегации и дезагрегации эритроцитаркых агрегатов в цельной крови методом регистрации рассеянного назад света и определение закономерностей изменения данных параметров в зависимости от состояния организма и влияния различных физических и химических факторов (лазерное облучение in vivo и in vitro, фотосенсибилизация).
Для достижения этой цели были решены следующие основные задачи:
разработана оптимальная схема нефелометра для одновременного измерения агрегационных и деформационных свойств эритроцитов и новый алгоритм вычисления параметров агрегации, дезагрегации и деформации;
в приближении Рэлея-Ганса-Дебая (РГД) описзно рассеяние света на начальном этапе агрегации модельных частиц, расчитаны кинетики рассеяния при различных начальных концентрациях частиц;
показано, что измеряемые параметры агрегации и дезагрегации эритроцитарных агрегатов чувствительны к изменению гематокрита, продолжительности и условиям хранения крови, а также к наличию патологии в организме человека;
исследовано влияние введения в кровь t'n vivo фотосенсибилизаторов (ФС), используемых при фотодинамической терапии рака, и инкубации цельной крови с ФС t'n vitro с последующим облучением на параметры процесса агрегации и прочность агрегатов;
получены количесі ~енные данные о влиянии лазерного облучения на разных длинах волн in vivo и in vitro на агрегациокные и деформационные характеристики эритроцитов в различном состоянии.
Новизна работы.
-
Предложена оптимальная схема нефелометра для изучения суспензий агрегирующих эритроцитов и разработан новый алгоритм вычисления параметров агрегации и дезагрегации: характерных времен образования линейных и трехмерных агрегатов, параметров прочности линейных и трехмерных агрегатов, деформируемости эритроцитов.
-
В приближении Рэлея-Ганса-Дебая (РГД) описано рассеяние света на начальном этапе агрегации модельных частиц, получены кинетики рассеяния при различных начальных концентрациях частиц.
-
Впервые обнаружено, что введение фотосенсибилизагоров фотогена и фотосенса в кровь in vivo и инкубация цельной крови с ФС in vitro инициирует замедление процесса агрегации и увеличение прочности агрегатов. Предложена биофизическая интерпретация эффектов изменения кинетики агрегации и дезагрегации.
-
Получены количественные данные о влиянии лазерного облучения на .разных длинах волн (633 и 890 ни) t'n vivo и' in vitro на агрегационные и деформационные характеристики эритроцитов в различном состоянии.
Б. Показано, что средние значения набора измеряемых параметров для четырех типов заболеваний, достоверно отличаются от нормальных, высказана гипотеза о связи замеченных аффектов агрегации с повышенным содержанием фибриногена и иммуноглобулина М (IgM) в случав аутоиммунных заболеваний.
Научная и практическая ценность работы,
Разработана методика одновременного измерения агрегационных м деформационных свойств эритроцитов в цельной крови путем регистрации рассеянного от слоя крови в направлении назад света. Проведенный комплекс исследований агрегации эритроцитов, разрушения эритроцитарных агрегатов в потоке, а также деформации красных клеток крови при высоких сдвиговых напряжениях вносит дополнительный вклад в понимание биофизических аспектов механизмов агрегации и дезагрегации эритроцитов.
Исследовано влияние агрегации эритроцитов на оптические свойства цельной крови. Рассчитаны кинетики светорассеяния при образовании линейных агрегатов для суспензий модельных частиц при различных начальных концентрациях в приближении РГД. Проведен сравнительный анализ теоретически рассчитанных кривых с экспериментальными данными, показано их качественное согласие.
Использование разработанной методики и алгоритма обработки сигнала для клинических исследований а Институте ревматологии РАН, ММА иы.Сеченоза позволило измерить средние значения измеряемых параметров для 4-х типов питологий. Проведен статистический анализ и сравнение полученных данных с показателями нормальной крови.
Показано, что при дозах до 3.5 Дж облучение крови in vitro на длине волны 633 км не изменяет параметров агрегации и дезагрегации, в то время как
облучение на длине волны 890 нм изменяет параметры агрегации и дезагрегации как i« vivo, так и in vitro.
Полученные результаты важны для разработки нового диагностического метода определения агрегационных свойств эритроцитов, который может использоваться в клинике внутренних болезней, клинической токсикологии, травматологии и др., а также для мониторинга эффективности терапевтических воздействий.
Результаты исследования влияния инкубации цельной крови в присутствии фотогема или фотосенса и последующего облучения крови на агрегационные свойства эритроцитов важны для выбора оптимальных характеристик конкретных фотосенсибилизаторов и режимов инкубации 'и облучения в процессе фотодинамической терапии рака.
Изучение режима неустойчивости потока крови в течении Куэтта (или Серла) и образования вихрей Тейлора представляет интерес для оценки устойчивости течения в бифуркациях модельных и нативных сосудов.
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации опубликованы в 13 печатных работах, докладывались и обсуждались на 9-ти конференциях и семинарах: Российской молодежной ассамблее "Молодежь и здоровье" (Саратов, 1992), 4-ой Международной конференции "Laser Applications in Life Sciences" (Еваскула, Финляндия, 1992), 6-ой Международной конференции ECIS/European Colloid and Interface Society (Грац, Австрия, 1992), Международных конференциях Biomedical Optics Europe (Будапешт, Венгрия, 1993; Лилль, Франция, 1994), конференции "Cell and Biotissue Optics" (Саратов, 1994), Международных конференциях BiOS Photonics West (Сан-Хосе, США, . 1995, 1996), Международной конференции ICONO'95 (Санкт-Петербург, 1995).